骨形態(tài)發(fā)生蛋白2及堿性成纖維生長因子2對大鼠骨髓間充質干細胞膜片增殖和成骨分化的影響

發(fā)布時間：2020-02-22所屬分類：醫(yī)學職稱論文瀏覽：1152次

摘 要： 摘要背景：現(xiàn)階段骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和堿性成纖維生長因子2對骨髓間充質干細胞膜片增殖、成骨分化的影響和作用機制還尚未可知，如何將生長因子與組織工程細胞膜片技術相整合，最終將其用于骨缺損修復具有重要意義。目的：探討單獨及聯(lián)合應用骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和堿

　　摘要背景：現(xiàn)階段骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和堿性成纖維生長因子2對骨髓間充質干細胞膜片增殖、成骨分化的影響和作用機制還尚未可知，如何將生長因子與組織工程細胞膜片技術相整合，最終將其用于骨缺損修復具有重要意義。目的：探討單獨及聯(lián)合應用骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和堿性成纖維生長因子2對骨髓間充質干細胞膜片增殖和成骨分化的影響。方法：體外分離培養(yǎng)鑒定SD大鼠骨髓間充質干細胞并構建細胞膜片，選用不同質量濃度的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和堿性成纖維生長因子2單獨及聯(lián)合誘導骨髓間充質干細胞膜片，CCK-8法結合堿性磷酸酶活性檢測確定2種因子促進膜片增殖和成骨分化的最佳有效質量濃度;然后對骨髓間充質干細胞膜片進行成骨誘導，通過大體及顯微鏡觀察、Vonkossa染色、茜素紅染色、RT-PCR檢測相關成骨標志物來評估誘導效果。結果與結論：單獨應用骨形態(tài)發(fā)生蛋白2可增強骨髓間充質干細胞膜片的堿性磷酸酶活性，最佳質量濃度為100μg/L(P<0.001)，單獨應用堿性成纖維生長因子2能加速骨髓間充質干細胞膜片的增殖，最佳質量濃度為20μg/L(P<0.001)，而聯(lián)合應用既可以促進膜片增殖又能提高其堿性磷酸酶活性(P<0.001);經(jīng)成骨誘導后，4組膜片在形態(tài)學上無明顯差異，均能誘導骨髓間充質干細胞膜片的成骨分化，其中聯(lián)合組鈣結節(jié)最明顯(P<0.001)，可顯著促進膜片晚期成骨分化并抑制其早期成骨分化，具有明顯的協(xié)同促進作用(P<0.001)。結果表明，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和堿性成纖維生長因子2聯(lián)合應用時具有協(xié)同作用，既可以促進骨髓間充質干細胞膜片增殖，又能顯著增強其成骨誘導能力。

　　關鍵詞：骨形態(tài)發(fā)生蛋白2;成纖維細胞生長因子2;細胞膜片技術;細胞增殖;成骨分化

　　0引言Introduction

　　細胞膜片技術是將高密度的細胞接種在培養(yǎng)皿上，使其相互重疊生長，分泌大量細胞外基質而形成的透明致密膜狀物[1]，自1993年由日本學者OKANO報道后，現(xiàn)已成為現(xiàn)代再生醫(yī)學領域應用的熱點。因其不需要酶解，從而能完整地保存細胞-基質、細胞間連接以及細胞表面相關蛋白等結構，能夠顯著提高細胞的利用率。近年來，該技術在皮膚[2]、腎臟[3]、牙周膜[4]、心肌等組織再生修復中已得到廣泛的應用[5]。目前已有將膜片技術用于骨缺損和軟骨缺損修復的實驗性研究，但尚缺乏臨床長期作用結果的支持[6]。此外，如何優(yōu)化制備技術，如何使細胞膜片與細胞因子更好的整合，如何使細胞膜片與支架材料優(yōu)勢結合以及相關通路機制研究等問題，仍有待進一步深入研究。

　　期刊推薦：《國際骨科學雜志》創(chuàng)刊于1964年，是國家級醫(yī)學學術類期刊，報道主要介紹國內外在骨科領域的臨床診治和基礎研究新動態(tài)、新技術、新進展和新成就，以脊柱、關節(jié)(人工關節(jié))、關節(jié)鏡、骨折治療、骨腫瘤、骨質疏松、顯微外科、手外科為重點。讀者為廣大骨科醫(yī)師及相關臨床醫(yī)師、研究人員和教學人員。有投稿需求的作者，可以咨詢期刊天空在線編輯。

　　在諸多生長因子中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bonemorphogeneticprotein2，BMP-2)和堿性成纖維細胞生長因子2(fibroblastgrowthfactor2，F(xiàn)GF-2)逐漸成為學者們研究的焦點。BMP-2是目前成骨誘導活性最強的生長因子，它能夠不可逆地誘導間充質干細胞向成骨細胞分化，增加Ⅰ型膠原的合成和骨鈣素等基因的表達，進而高效地促進骨組織形成[7-8]。FGF-2對外胚層和中胚層來源的細胞有明顯趨化作用，是多種細胞形態(tài)發(fā)生和分化的主要因子[9]。有文獻報道，F(xiàn)GF-2有促進骨髓間充質干細胞增殖、遷移和分化的作用[10]。然而，BMP-2和FGF-2單獨或聯(lián)合應用于骨髓間充質干細胞膜片，其增殖和分化是否具有協(xié)同作用尚未可知。

　　實驗擬用BMP-2及FGF-2單獨及聯(lián)合誘導骨髓間充質干細胞膜片，觀察其增殖和成骨分化能力，探究其相關作用機制，以期將細胞因子、細胞膜片技術與支架材料的優(yōu)勢相整合，最終為細胞膜片技術應用于骨缺損修復開拓新的思路和方法。

　　1材料和方法Materialsandmethods

　　1.1設計細胞學體外觀察實驗。

　　1.2時間及地點實驗于2018年6月至2019年1月在新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學研究中心干細胞實驗室完成。

　　1.3材料

　　1.3.1實驗動物4周齡SD大鼠30只，雌雄不限，體質量40-50g，由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供，SPF級，許可證號：SCXK(新)2016-0003。

　　1.3.2實驗試劑和儀器α-MEM培養(yǎng)液(Hyclone，美國);胎牛血清(四季青，中國);ratBMP-2(Peprotach，美國);ratFGF-2(Peprotach，美國);RT-PCR試劑盒(QIAGEN，德國);CCK-8(Dojindo,日本);反轉錄試劑盒(Takara，日本);引物序列(上海生物工程公司，中國);RT-PCR儀(Bio-RAD，美國);倒置相差顯微鏡及拍照系統(tǒng)(萊卡，德國);酶標儀(Thermo，美國);超凈工作臺(蘇州凈化設備廠);CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo，美國)。

　　1.4實驗方法

　　1.4.1大鼠骨髓間充質干細胞的分離培養(yǎng)和鑒定將SD大鼠脫頸處死后，用體積分數(shù)為75%乙醇溶液浸泡消毒5min。在無菌條件下，分離股骨和肱骨，剪開骨骺端，用5mL注射器吸培養(yǎng)液沖出骨髓，反復吹勻后，離心棄上清，重懸于25cm2細胞培養(yǎng)瓶中。首次換液于72h后，每兩三天換1次液，當細胞長至85%-90%融合時，用胰酶消化并按合適的比例傳代。取第2代骨髓間充質干細胞經(jīng)胰酶消化計數(shù)，避光條件下，分別加入2μL的相關抗體CD29、CD45和CD44，并設立陰性對照組，于4℃孵育30min，加入1mL預冷的PBS離心洗滌2次，再加入500μLPBS吹打混勻，上流式細胞儀鑒定，取第2，3代細胞用于以下實驗。

　　1.4.2制備骨髓間充質干細胞膜片用胰酶消化重懸細胞，以2×104個/孔的密度接種到24孔板中，每孔加入α-MEM培養(yǎng)液1mL，每2d換液1次。待板內細胞融合至100%時，更換培養(yǎng)液為成膜誘導液(α-MEM+體積分數(shù)為10%胎牛血清+1%谷氨酰胺+50μmol/L維生素C+1%青鏈霉素)，每2d換液1次。

　　1.4.3骨髓間充質干細胞膜片的增殖活性培養(yǎng)5-7d后骨髓間充質干細胞膜片形成，用不含血清的α-MEM培養(yǎng)液饑餓24h，再更換為含體積分數(shù)為10%胎牛血清、5%雙抗、5%谷氨酰胺的α-MEM完全培養(yǎng)液，然后加入生長因子：BMP-2組和FGF-2組分別添加不同質量濃度的BMP-2(50，100，200μg/L)和FGF-2(5，10，20μg/L)，聯(lián)合組添加100μg/LBMP-2和20μg/LFGF-2(同時加入，無先后順序)，對照組僅添加α-MEM完全培養(yǎng)液(不含BMP-2和FGF-2)，培養(yǎng)3，7d，每組3個復孔。按CCK-8試劑盒說明操作，在酶聯(lián)儀450nm光波下測定吸光度值并記錄。

　　1.4.4骨髓間充質干細胞膜片的堿性磷酸酶活性按上述方法添加不同質量濃度BMP-2和FGF-2誘導3，7d后，PBS沖洗1次，0.1%TritonX-100裂解細胞膜片，反復吹打1min。按堿性磷酸酶活性檢測試劑盒說明進行操作，測定405nm波長下吸光度值。以每分鐘水解para-nitrophenylphosphate顯色底物產生1μmol/Lp-nitrophenol所需的堿性磷酸酶的量定義為一個酶活力單位。

　　1.4.5BMP-2及FGF-2誘導骨髓間充質干細胞膜片的成骨分化將細胞以1×106個/孔的密度接種到6孔板中，按照上述方法構建細胞膜片，配制成骨誘導液(α-MEM+體積分數(shù)為5%胎牛血清+10nmol/Lβ-甘油酸鈉+100nmol/L地塞米松+50μmol/L維生素C)，在實驗組成骨誘導液中單獨及聯(lián)合添加100μg/LBMP-2、20μg/LFGF-2兩種因子(同時加入，無先后順序)，對照組僅添加成骨誘導液，每孔2mL，每3d換液1次。

　　(1)形態(tài)學觀察：第7天時，大體及顯微鏡觀察各組細胞膜片的生長情況和表面形態(tài)，并拍照記錄。

　　(2)Vonkossa染色：第7，14，21天時，40g/L多聚甲醛固定膜片30min，PBS緩慢沖洗2次，加入Vonkossa銀溶液，紫外線下照射5-10min，蒸餾水沖洗1min，海波溶液處理2min，鏡下觀察并拍照。每組重復3次。

　　(3)茜素紅染色和半定量分析：第7，14，21天時，40g/L多聚甲醛固定30-60min，加入1%茜素紅染液染5-20min，鏡下觀察并拍照。半定量測定：分別加入脫色液1mL溶解于10mmol/L磷酸鈉溶液中，將染液完全脫下來，取上清液于450nm測吸光度值。每組重復3次。

　　(4)RT-PCR檢測成骨相關mRNA：用Trizol法裂解4組細胞膜片，提取各組總RNA，分別測定其純度、濃度，選擇純度值在1.8至2.0之間的總RNA，然后反轉錄獲得cDNA，最后用PT-PCR試劑盒檢測相關成骨基因(Runx2/cbfa1、BMP-2、COL-1)的表達量，引物序列見表1。通過公式X=2-ΔΔCt計算各實驗組目的基因較對照組的相對表達水平。實驗重復檢測3次。

　　1.5主要觀察指標①BMP-2及FGF-2誘導后骨髓間充質干細胞膜片增殖情況、堿性磷酸酶活性;②成骨分化后骨髓間充質干細胞膜片形態(tài)、Vonkossa染色、茜素紅染色和半定量分析以及相關成骨標志物Runx2/cbfa1、BMP-2、collagen-1的表達。

　　1.6統(tǒng)計學分析實驗數(shù)據(jù)均用x_±s表示，運用SPSS24.0軟件進行多組間one-wayANOVA分析，組內數(shù)據(jù)比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有顯著性意義。

　　2結果Results

　　2.1骨髓間充質干細胞的表型鑒定結果流式細胞術鑒定大鼠骨髓干細胞表面標志物，間充質干細胞抗原CD29(82.4%)呈陽性表達，造血干細胞抗原CD45(2%)呈陰性表達，以上結果皆符合間充質來源的干細胞特征，見圖1。

　　2.2骨髓間充質干細胞膜片的增殖情況與對照組相比，單獨應用BMP-2對骨髓間充質干細胞膜片的增殖無明顯影響，與時間和濃度均無關(P>0.05);而單獨應用FGF-2能明顯促進骨髓間充質干細胞膜片的增殖(P<0.01)，呈時間和濃度依賴性，培養(yǎng)至第7天時，3個質量濃度中20μg/L為最佳有效質量濃度(P<0.001);聯(lián)合組(100μg/LBMP-2和20μg/LFGF-2)在第3天和第7天時，促進膜片增殖的能力明顯高于同一時間內二者單獨應用組(P<0.001)，并與時間呈相關性，見圖2。

　　2.3骨髓間充質干細胞膜片的堿性磷酸酶活性與對照組比較，單獨應用BMP-2可明顯促進骨髓間充質干細胞膜片的堿性磷酸酶活性(P<0.01)，其效應會隨著BMP-2質量濃度的增加而逐漸增強，當質量濃度為100μg/L時，膜片的堿性磷酸酶活性最強(P<0.001)，且具有時間依賴性;單獨應用FGF-2也可提高細胞膜片的堿性磷酸酶活性(P<0.01)，但不受質量濃度變化的影響;而聯(lián)合應用100μg/LBMP-2和20μg/LFGF-2可顯著提高骨髓間充質干細胞膜片的堿性磷酸酶活性(P<0.001)，并與時間呈相關性，見圖3。

　　2.4骨髓間充質干細胞膜片成骨分化后的形態(tài)變化體外培養(yǎng)7d后，在6孔板底部可見4組膜片均形成半透明薄膜樣結構，邊緣有褶皺形成，質地柔軟，可用鑷子沿板的邊緣完整揭起。在倒置相差顯微鏡下觀察，4組膜片均呈復層生長并含有大量細胞外基質，這表明單獨或聯(lián)合應用BMP-2和FGF-2對膜片的形態(tài)結構無影響，見圖4。

　　2.5骨髓間充質干細胞膜片成骨分化后Vonkossa染色結果對于胞漿內鈣鹽的沉積，在第7天時，對照組幾乎無變化，聯(lián)合組、BMP-2組和FGF-2組的鈣鹽開始逐漸沉積，其中聯(lián)合組最明顯，呈黑褐色。第21天時，聯(lián)合組胞漿中鈣鹽沉積最多，顏色最深，見圖5A。

　　2.6骨髓間充質干細胞膜片成骨分化后茜素紅染色和半定量分析在相同的時間內，聯(lián)合組的成骨誘導能力最強，有大量片狀暗紅色鈣結節(jié)形成，此外，BMP-2組較FGF-2組明顯，對照組雖有紅色鈣結節(jié)出現(xiàn)，但相對較少，隨著成骨誘導時間的增加，各組鈣化面積也明顯增大，見圖5B。對骨髓間充質干細胞膜片表面鈣結節(jié)半定量分析：聯(lián)合組是對照組的1.4-2.0倍，是BMP-2組和FGF-2組的1.1-1.6倍，見圖6。

　　2.7骨髓間充質干細胞膜片成骨分化后成骨基因的表達成骨誘導7d后，與對照組相比，聯(lián)合組、BMP-2組和FGF-2組骨髓間充質干細胞膜片中COL-1的表達降低，聯(lián)合組表達量下降明顯(P<0.001);同時BMP-2和Runx2/cbfa1的表達顯著增加(P<0.001)，其中聯(lián)合組表達量最高，說明BMP-2和FGF-2均能促骨髓間充質干細胞膜片的成骨分化，其中聯(lián)合組具有顯著的協(xié)同誘導作用，見圖7。

　　3討論Discussion

　　隨著組織工程細胞膜片的相關研究與日俱進，采用外源性生長因子對細胞膜片進行修飾，以長期高效的促進骨組織愈合具有廣泛的研究前景。骨髓間充質干細胞具有分化為骨、軟骨、神經(jīng)和脂肪的能力，是重要的種子細胞來源[11-12]。實驗以骨髓間充質干細胞作為種子細胞，經(jīng)流式細胞術鑒定其表面間充質干細胞抗原CD29(82.4%)呈陽性表達，造血干細胞抗原CD45(2%)呈陰性表達，符合間充質來源的干細胞特征，該方法快速穩(wěn)定且不易影響細胞活性，是鑒定細胞的有效方法。

　　現(xiàn)階段BMP-2和FGF-2對細胞增殖、分化的研究結果不盡相同，導致這種差異的原因一方面與作用細胞的不同有關，另一方面也受培養(yǎng)環(huán)境的影響[13-14]。眾所周知，生長因子發(fā)揮生物效應很大程度上受其濃度影響，同時定量檢測堿性磷酸酶能夠直接反映成骨分化的早期情況，其活性越高，說明前成骨細胞向成熟的成骨細胞分化越明顯[15]。因此，該實驗應用不同質量濃度的BMP-2和FGF-2誘導骨髓間充質干細胞膜片，結果顯示，聯(lián)合應用時具有協(xié)同誘導膜片增殖和成骨分化的作用，單獨應用FGF-2能加速膜片的增殖，而單獨應用BMP-2對膜片增殖活性基本無影響，但均能促進膜片的成骨分化。有些研究認為，F(xiàn)GF-2存在低濃度促進、高濃度抑制細胞增殖活性的作用[16]，這可能與細胞種類和生長因子的處理方式不同有關。該實驗參考張戎[13]和PALIOTO等[17]提供的方法，確定了單獨及聯(lián)合應用BMP-2和FGF-2促進細胞膜片增殖和成骨的最佳質量濃度，即100μg/LBMP-2和20μg/LFGF-2，并用于后續(xù)實驗。

　　細胞膜片技術最早是由日本學者OKANO等利用溫敏培養(yǎng)皿制備出來的，目前常用的膜片制備技術包括溫度感應式培養(yǎng)技術、外科剝離和維生素C誘導法。有學者報道稱維生素C誘導法制備細胞膜片簡單方便，有著更好的生物學和機械性能[18]。因此，該實驗也采用維生素C誘導法，從而簡單有效地獲得了骨髓間充質干細胞膜片，也驗證了此方法的可行性。根據(jù)實驗分組，采用100μg/LBMP-2和20μg/LFGF-2連續(xù)誘導細胞膜片，于第7天在板底部均可見4組膜片形成乳白色半透明薄膜樣結構，邊緣有褶皺形成，質地柔軟，沿著邊緣可完整揭起，同時通過顯微鏡觀察都含有豐富的細胞外基質，這表明用生長因子誘導骨髓間充質干細胞膜片不會影響其形態(tài)結構。

　　由于BMP-2有很強的成骨誘導能力，而FGF-2能促進細胞增殖和血管再生，二者參與骨形成的作用機制不同，但存在協(xié)同效應，目前已有研究將其聯(lián)合用于骨缺損的再生與修復中[19-20]。鈣結節(jié)的形成能夠直觀反映骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化的程度，是細胞成骨分化進入到礦化階段的有力證據(jù)。該實驗通過vonkossa染色、茜素紅染色來鑒定鈣結節(jié)，以此對比分析BMP-2和FGF-2誘導骨髓間充質干細胞膜片的成骨分化程度。結果發(fā)現(xiàn)，BMP-2組的鈣結節(jié)均較FGF-2組增多，聯(lián)合組則有大量的片狀鈣結節(jié)形成，呈黑褐色或暗紅色;同時，半定量結果指出聯(lián)合組的鈣結節(jié)數(shù)量是BMP-2組和FGF-2組的1.1-1.6倍，是對照組的1.4-2.0倍，從而直觀而準確地反映了隨時間變化二者可使鈣鹽沉積并逐漸形成類骨質。這與QI等[21]的研究結果一致。但也有文獻報道，當FGF-2質量濃度高于10μg/L時，F(xiàn)GF-2會與其表面受體和細胞外基質之間達到飽和狀態(tài)[22]，鈣結節(jié)的數(shù)量不會再隨質量濃度升高而繼續(xù)增多，因而制約了對骨髓間充質干細胞成骨誘導的作用。在此實驗中FGF-2的有效質量濃度可達到20μg/L，這可能與骨髓間充質干細胞膜片表面存在大量的細胞外基質、豐富的連接蛋白(如離子通道、生長因子受體等)和受體功能的高超高含量耐受性有關，從而使BMP-2和FGF-2充分發(fā)揮了對骨髓間充質干細胞膜片的成骨誘導作用。

　　RT-PCR結果顯示，F(xiàn)GF-2及BMP-2能夠促進膜片成骨基因的表達，在第7天時COL-1呈下降趨勢，而Runx2/cbfa1、BMP-2出現(xiàn)上升趨勢。COL-1通常出現(xiàn)在成骨的早期階段，由成骨細胞合成、分泌纖維膠原成分[23]，這說明聯(lián)合組、BMP-2組和FGF-2組可能逐漸進入成骨分化的中晚期階段，而晚期成骨基因BMP-2的表達量顯著增高恰好可以說明這一點。然而，骨轉錄因子Runx2/cbfa1會出現(xiàn)晚期抑制成骨分化的作用，但在此實驗中Runx2/cbfa1呈上升趨勢。有研究證實，BMP-2能與細胞表面受體BMPRs結合來激活Smad1/5/8信號通路從而上調FGF-2和Runx2/cbfa1的表達[24-25];而FGF-2通過與表面受體FGFRs結合經(jīng)Ras/MAPK/ERK信號通路來激活Runx2/cbfa1、BMP-2及其受體BMPRs[26]，也就是說，實驗中的BMP-2和FGF-2可能通過與膜片表面分泌的大量生長因子受體相互作用協(xié)調，緊接著激活Smad信號通路和Ras/MAPK/ERK信號通路，從而上調了Runx2/cbfa1的表達，最終促進骨髓間充質干細胞膜片的成骨分化，因此實驗中Runx2/cbfa1呈上升趨勢。通過比較各組COL-1、Runx2/cbfa1、BMP-2的表達量可以推測，聯(lián)合組是通過調節(jié)二者間錯綜復雜的信號通路，來完成協(xié)同誘導作用，最終顯著促進細胞膜片向成骨細胞的分化。

　　綜上所述，BMP-2及FGF-2聯(lián)合應用時具有協(xié)同作用，既可以促進骨髓間充質干細胞膜片的增殖，又能顯著增強其成骨誘導能力，為生長因子在細胞膜片技術中的應用提供了新的思路和方法，后期課題組將從蛋白水平和動物體內實驗繼續(xù)進一步研究，以期在相關通路機制、生長因子與組織工程細胞膜片優(yōu)勢結合等關鍵性問題上有所突破，使其真正的發(fā)揮臨床作用，仍需要不懈的努力。

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