發布時間：2020-02-22所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要背景：補骨脂素是屬于植物類雌激素，有大量研究證實其具有促進細胞增殖分化的作用。目的：應用補骨脂素、兔骨內膜間充質干細胞和聚己內酯支架構建人工復合骨，探討其治療兔骨不連的效果。方法：①將第3代兔骨內膜間充質干細胞接種于細胞培養板中，分別加
摘要背景：補骨脂素是屬于植物類雌激素，有大量研究證實其具有促進細胞增殖分化的作用。目的：應用補骨脂素、兔骨內膜間充質干細胞和聚己內酯支架構建人工復合骨，探討其治療兔骨不連的效果。方法：①將第3代兔骨內膜間充質干細胞接種于細胞培養板中，分別加入10-8，10-7，10-6mol/L補骨脂素、50mg/L骨形態發生蛋白2進行干預，對照組加入同體積的無菌純凈水。干預第3，5，7天采用MTT法檢測細胞增殖情況;②將聚己內酯三維支架加入到細胞培養板底部，兔骨內膜間充質干細胞按1×103/孔的量接種于支架上，然后加入10-6mol/L補骨脂素，聯合培養21d后取出即為人工復合骨;③27只新西蘭大白兔隨機均分為3組，建立橈骨骨不連模型，實驗組植入人工復合骨，支架組單純植入支架，對照組不植入任何材料。術后2，4，8周行病理學蘇木精-伊紅染色，觀察成骨情況。術后第4周拍攝X射線片，觀察骨不連愈合情況。結果與結論：①3種濃度補骨脂素均有誘導兔骨內膜間充質干細胞增殖的作用，與對照組比較，10-6mol/L補骨脂素對兔骨內膜間充質干細胞刺激作用最強(P<0.05)，而且10-6mol/L補骨脂素組與陽性對照骨形態發生蛋白2組相比差異無顯著性意義(P>0.05);②新西蘭大白兔橈骨中段骨不連組織蘇木精-伊紅染色結果顯示，實驗組成骨細胞數目明顯多于支架組和對照組(P<0.05);③X射線片結果顯示，實驗組骨不連已經愈合，支架組骨折部分愈合，對照組骨不連未愈合;④結果表明，補骨脂素對兔骨內膜間充質干細胞增殖作用與濃度有一定的相關性。補骨脂素可結合兔骨內膜間充質干細胞及聚己內酯支架形成人工復合骨，通過動物實驗證實其治療骨不連效果較好。
關鍵詞：補骨脂素;兔骨內膜間充質干細胞;細胞增殖;細胞支架;骨不連
0引言Introduction
骨不連在臨床實際工作中比較常見，其治療主要包括物理療法、生物療法和手術治療。物理療法包括體外沖擊波治療、低頻脈沖治療、電刺激療法等;生物療法包括骨生長因子治療、骨髓和干細胞移植治療、骨組織工程治療;手術治療包括骨移植、內固定治療、外固定治療等。越來越多學者認為骨組織工程治療骨不連是醫學發展的趨勢，并且有獨特的效果。
補骨脂素來源于豆科植物補骨脂，是一種植物類雌激素，有研究表明補骨脂素對細胞增殖有一定的功效[1]。聚己內酯是一種生物相容性良好并可被機體吸收的生物材料，受到研究學者的廣泛重視[2]。兔骨內膜間充質干細胞分離自骨膜，是一種有自我更新和分化能力的骨膜細胞。實驗采用補骨脂素誘導兔骨內膜間充質干細胞擴增后植入聚己內酯三維支架中構建人工復合骨，探討人工復合骨對兔骨不連的治療效果，為補骨脂素誘導兔骨內膜間充質干細胞增殖并運用于骨組織工程提供實驗依據。
1材料和方法Materialsandmethods
1.1設計細胞學體外實驗和隨機對照動物實驗。
1.2時間及地點實驗于2018年6至12月在廣州中醫藥大學分子生物實驗室完成。
1.3材料補骨脂素(上海士鋒生物科技有限公司);胰蛋白酶(上海嶸崴達實業有限公司);兔骨內膜間充質干細胞(武漢巴菲爾生物技術服務有限公司);四甲基偶氮唑藍(MTT)(Sigma，美國);二甲基亞砜(北京百奧萊博科技有限公司);DMEM-F12培養基(Gibco，美國);聚己內酯三維支架(上海研謹生物科技有限公司);抗壞血酸、地塞米松(上海嶸崴達實業有限公司);倒置相差顯微鏡(Olympus，日本);二氧化碳恒溫培養箱(Thermo，美國);自動酶標分析儀(北京科瑞美科技有限公司);細胞培養板(上海嶸崴達實業有限公司);超凈工作臺(北京佳源興業科技有限公司)。
實驗動物：新西蘭大白兔27只，體質量約1.5kg，雌雄不限，由廣州中醫藥大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK(粵)2018-0149。
1.4實驗方法
1.4.1兔骨內膜間充質干細胞培養兔骨內膜間充質干細胞購買自武漢巴菲爾生物技術服務有限公司，購買后接種于含DMEM-F12培養基的細胞培養皿中常規培養，每3d換液1次，顯微鏡下觀察細胞增殖情況，當細胞增殖到鋪滿培養皿底部時，即用0.25%胰蛋白酶消化，傳代繼續培養，第3代細胞用于后續實驗。
1.4.2補骨脂素誘導兔骨內膜間充質干細胞增殖將第3代兔骨內膜間充質干細胞接種于細胞培養板中，調整細胞濃度為1×103/孔。實驗分5組，每組5個復孔，分別為補骨脂素低、中、高濃度組(10-8，10-7，10-6mol/L)、骨形態發生蛋白2組、對照組。骨形態發生蛋白2組僅加入骨形態發生蛋白2(50mg/L)，對照組加入同體積的無菌純凈水。干預第3，5，7天檢測吸光度值，簡略步驟：加入MTT(5g/L)20µL，置于37℃，體積分數為5%CO2恒溫培養箱中培養4h，加入0.15mL二甲基亞砜，結晶溶解后檢測各組吸光度值，每次重復檢測3次，取均值。
1.4.3兔骨內膜間充質干細胞與聚己內酯三維支架構建人工復合骨將兔骨內膜間充質干細胞以1×107L-1細胞濃度接種于細胞培養板內，然后將聚己內酯三維支架放于細胞培養孔中，加入含有10-6mol/L補骨脂素的DMEM-F12培養液，每3d更換細胞培養液1次，第14天取出細胞支架復合物用于后續實驗。
1.4.4動物骨不連模型的建立及人工復合骨的植入取27只1.5kg左右的新西蘭大白兔，隨機分為3組，每組9只。首先刮除下肢毛發，戊巴比妥鈉麻醉至大白兔活動無力，用手術刀分離右前肢橈骨中段的皮膚組織，暴露出骨質后，剪除一整段約1.5cm的骨質，實驗組植入人工復合骨，支架組單純植入聚己內酯三維支架，對照組無植入物，術后在同一飼養環境下飼養。
1.4.5蘇木精-伊紅染色術后第2，4，8周，各組分別處死3只新西蘭大白兔，剔除毛發，切開皮膚，分離暴露骨不連處骨質，截取0.8cm組織塊，先用40g/L多聚甲醛浸潤，然后用脫鈣液和乙醇分別處理，脫去鈣質和水分，石蠟包埋后進行蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察成骨細胞數量[3]。
1.4.6X射線攝片檢測骨不連術后第4周，處死之前用X射線機拍片檢測骨不連愈合情況(型號：warianRAD-14)，拍片設定為：管電流80mA，管電壓50kV，焦距90cm，曝光時間0.3s。
1.5主要觀察指標①兔骨內膜間充質干細胞增殖情況;②骨不連處病理切片形態和成骨細胞計數;③骨不連處大體X射線片觀察骨愈合情況。
1.6統計學分析統計學軟件用SPSS17.0，數據以x_±s表示，組內比較采用方差分析，組間差異用最小顯著差異法(LSD法)，P<0.05為差異有顯著性意義。
2結果Results
2.1兔骨內膜間充質干細胞增殖情況各組兔骨內膜間充質干細胞增殖見表1，圖1。各組吸光度值總體均隨時間延長而增加，以第7天吸光度值最大。與對照組相比，不同濃度補骨脂素組及骨形態發生蛋白2組各時間點吸光度值均升高(P<0.05);與骨形態發生蛋白2組相比，補骨脂素高濃度組吸光度值差異無顯著性意義(P>0.05)，補骨脂素中濃度組及補骨脂素低濃度組吸光度值均小于骨形態發生蛋白2組(P<0.05)。
2.2實驗動物數量分析
27只新西蘭大白兔參加實驗，中途無脫落，均進入結果分析。
2.3蘇木精-伊紅染色切片成骨細胞計數情況各組切片蘇木精-伊紅染色后成骨細胞計數見表2，圖2。支架組及實驗組在第2，4，8周成骨細胞逐漸增多，對照組僅第4周有所增多，第8周比第4周減少。與對照組相比，支架組和實驗組在各個時間點成骨細胞數量均增多(P<0.05);與支架組相比，實驗組在各個時間點成骨細胞數量均增多(P<0.05)。
2.4各組橈骨中段骨不連組織病理形態術后4周，實驗組見大量新生的骨質，呈編織樣，少量微血管，骨細胞散在各處骨質端，見圖3A;支架組新生骨及骨細胞比實驗組少，有比較多的細血管，骨折端不完全被骨質代替，見圖3B;對照組顯微鏡下可見大量的細小血管和肉芽組織，骨細胞少，有多處鈣化點，見圖3C。
2.5各組術后4周影像學觀察骨愈合情況實驗組骨不連已經愈合，未見骨折線，骨皮質致密，骨髓腔已經貫通，骨小梁呈網格狀排列，見圖4A;支架組骨皮質未完全相連，髓腔部分貫通，骨折部分愈合，骨小梁存在，見圖4B;對照組骨不連未愈合，骨間隙清晰存在，見圖4C。
3討論Discussion
豆科植物提取物補骨脂素用于骨組織工程的研究較少，以往研究骨組織工程治療骨不連常常選用注射成骨因子、植入自體骨髓等方法，該研究體外培養兔骨內膜間充質干細胞，用聚己內酯支架為載體，補骨脂素為誘導刺激劑，成功構建了內含活細胞的復合人工骨。實驗建立標準的動物骨不連模型，植入復合人工骨后通過切片和影像學觀察其實際效果，為補骨脂素運用于骨組織工程提供一種新的思路。
補骨脂素提取自補骨脂、珊瑚菜、蕓香等植物，屬于香豆素類，是一種植物雌激素，有多種生物活性作用，如抗骨質疏松、抗白血病、抗子宮出血、抗哮喘、治療骨折、促進細胞增殖等[4-5]。多位學者證實，補骨脂素有抗骨質疏松的作用[6-8]，黃奎等[9]建立大鼠骨質疏松模型，采用補骨脂素灌胃，并通過鉬靶X射線及生物力學等方法證實補骨脂素能有效改善骨折愈合質量和生物學功能。楊伊姝等[10]建立了大鼠強迫游泳及懸尾等抑郁模型，用不同劑量的補骨脂素干預，發現補骨脂素有抗抑郁的效應。還有研究建立骨髓間充質干細胞培養體系，發現補骨脂素能影響Notch信號通路，從而有抗骨質疏松的作用[11]。李少鵬等[12]采用CCK-8、Westernblot、流式細胞術等方法證實補骨脂素對前列腺癌細胞的抑制作用具有劑量依賴性，說明補骨脂素有抗腫瘤作用。霍力為等[13]從乳鼠頭蓋骨獲得骨細胞并進行體外培養，MTT法檢測發現補骨脂素對乙醇誘導的成骨細胞有明顯的促增殖功效。另外還有研究認為補骨脂素有抑制成骨細胞凋亡、促進成骨細胞增殖的功能[14-17]。
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細胞支架要滿足多個條件[18-19]：①機體能耐受，無毒性，有良好生物相容性;②可被機體自然降解，并且降解后能被機體吸收;③有合適細胞增殖的三維空間;④有良好的可塑性，能塑形為不同的形態結構;⑤支架表面和細胞膜能有效接觸，細胞可有效附著在上面。目前組織工程支架包括生物類、異種材料類、人工復合物類。生物類取材機體自身，如自體髂骨，無免疫排斥性，但對機體有明顯的損傷，且無法大量獲得;異種材料類包括膠原海藻、羥基磷灰石等，但有生物相容性差、無法降解、免疫排斥等缺點;聚己內酯細胞支架有可吸收降解、能塑形、細胞容易在內增殖等優點，是組織工程中有潛力的一種支架材料[2，20]。課題組通過補骨脂素持續刺激聚己內酯支架中的兔骨內膜間充質干細胞，成功構建了人工復合骨，并通過動物模型驗證其性能，蘇木精-伊紅染色發現，實驗組見大量新生的骨質，呈編織樣，少量微血管，骨細胞散在各處骨質端，而純支架組無論是骨質礦化，還是骨細胞數量均較少。說明該人工復合骨治療骨不連，能夠縮短骨愈合時間，提高成骨質量，同時也說明補骨脂素誘導兔骨內膜間充質干細胞增殖是有效獲得骨組織工程種子細胞的方案。通過X射線攝片，進一步證實了組織學的結論，術后4周復合骨能完全治愈骨不連，而支架組只能使部分骨缺損愈合。
兔骨內膜間充質干細胞一般分離自四肢管狀骨的骨內膜，骨內膜是一層組織膜，含有成骨細胞前體細胞、血管、神經、結締組織等，是修復骨重要的解剖結構[21-23]。骨內膜內的間質干細胞有高度增殖、分化和更新的能力，可向骨及軟骨定向分化，因此可作為良好的種子細胞。補骨脂素是一種植物類雌激素，因其對成骨細胞、癌細胞、平滑肌細胞、骨髓間充質干細胞均有影響而被越來越多的學者關注[24-25]。
實驗用補骨脂素誘導兔骨內膜間充質干細胞，發現10-6mol/L補骨脂素組骨內膜間充質干細胞增殖的吸光度值最高，說明10-6mol/L補骨脂素有最大的誘導細胞增殖的作用。骨形態發生蛋白2是骨形態發生蛋白家族中有明確誘導成骨作用的因子[26-27]，實驗選用骨形態發生蛋白2作為陽性對照物進一步說明了補骨脂素對細胞的促進分化作用。實驗發現補骨脂素組與骨形態發生蛋白2組細胞吸光度值差異無顯著性意義，說明10-6mol/L補骨脂素具有和骨形態發生蛋白2同等效力的促進骨內膜間充質干細胞增殖的生物學效應。
應用補骨脂素、兔骨內膜間充質干細胞和聚己內酯三維支架構建人工復合骨，并通過動物實驗證實其可治愈骨不連。補骨脂素對骨膜細胞的作用機制可能與植物類雌激素類似，其作用機制可能和細胞表面雌激素受體及MAPK通路相關[28-29]，但其詳細機制尚需要進一步的研究。
SCISSCIAHCI
