發布時間：2020-02-22所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要背景：超負荷量的運動會引起體內氧化活性物質大量堆積從而損害骨骼肌細胞，而線粒體在運動過程能量代謝中具有關鍵作用。研究表明，紅景天可以減少肌組織脂質過氧化水平，保護受損內皮細胞。目的：探討紅景天通過調節線粒體功能改善大強度運動小鼠骨骼肌
摘要背景：超負荷量的運動會引起體內氧化活性物質大量堆積從而損害骨骼肌細胞，而線粒體在運動過程能量代謝中具有關鍵作用。研究表明，紅景天可以減少肌組織脂質過氧化水平，保護受損內皮細胞。目的：探討紅景天通過調節線粒體功能改善大強度運動小鼠骨骼肌細胞的功能。方法：實驗方案經西安石油大學倫理委員會批準。選擇40只SPF級BALB/c小鼠，根據干預措施的不同，將小鼠分為空白對照組、單純運動組、紅景天對照組、紅景天運動干預組。①空白對照組：不進行運動;②單純運動組：采用生理鹽水灌胃后，進行大強度運動;③紅景天對照組：將紅景天與生理鹽水懸濁液灌胃，不運動;④紅景天運動干預組：紅景天干預措施同紅景天對照組，運動方案同單純運動組。以上各組干預措施均為每天1次，連續28d。觀察小鼠的體質量、前肢握力、力竭時間;WesternBlot檢測骨骼肌錳超氧化物歧化酶蛋白、p53蛋白、線粒體起源、自噬啟動相關蛋白表達;RT-qPCR檢測骨骼肌Mfn-1、Mfn-2、Opa-1、Drp-1、fis-1mRNA表達。結果與結論：①從第2周開始，單純運動組小鼠前肢握力顯著低于其他3組(P<0.05)，但空白對照組、紅景天對照組與紅景天運動干預組之間，小鼠前肢握力始終無明顯差異(P>0.05);②第3，4周時，單純運動組小鼠負重游泳訓練力竭時間均顯著短于紅景天運動干預組(P<0.05);③單純運動組小鼠骨骼肌細胞內的錳超氧化物歧化酶、p53蛋白表達顯著高于其他組小鼠(P<0.05)，紅景天運動干預組小鼠骨骼肌細胞內的錳超氧化物歧化酶、p53蛋白表達顯著高于紅景天對照組(P<0.05);④與空白對照組相比，單純運動組小鼠骨骼肌內PGC-1α、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平明顯升高，Atg7、P62水平顯著下降(均P<0.05)，與紅景天對照組相比，紅景天運動干預組PGC-1α、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平明顯升高，Atg7、P62水平顯著下降(均P<0.05);⑤與空白對照組相比，單純運動組的融合基因表達下降，分裂基因Drp-1mRNA表達上升(P<0.05);紅景天運動干預組的融合基因表達也呈下降趨勢，Drp-1mRNA表達水平呈上升趨勢，但差異無顯著性意義(P>0.05);⑥結果說明，紅景天可顯著提高大強度運動量小鼠的運動耐力，這可能與改善了骨骼肌線粒體自噬、起源及線粒體融合-分裂有關。
關鍵詞：紅景天;線粒體;運動;骨骼肌;錳超氧化物歧化酶;線粒體融合基因
0引言Introduction
骨骼肌是人體運動的動力系統，其結構、功能與運動訓練密切相關[1]。適宜的訓練量可明顯增強肌肉纖維的收縮力，使肌纖維增粗，優化肌肉群的運動能力。但在超負荷運動情況下，骨骼肌細胞會受到不同程度的傷害，嚴重時甚至會破壞原有正常結構，造成功能障礙[2-4]，這與體內氧化活性物質大量堆積有關。而線粒體在能量代謝過程中起著關鍵性的樞紐作用，其功能狀態直接決定著肌肉功能[5-7]。紅景天是一類生長于極地高寒地區的草本植物，生命力頑強，其根莖具有補氣清肺、抗腫瘤、抗心血管疾病的作用[8-10]。近年來，紅景天被逐漸應用于運動醫學研究，但尚未見與大強度運動量后骨骼肌功能相關性的報道。因此，研究收集了40只BALB/c小鼠為研究對象，探討紅景天通過調節線粒體功能改善大強度運動量小鼠骨骼肌功能的機制，以期為臨床實際應用提供理論基礎。
1材料和方法Materialsandmethods
1.1設計隨機對照動物實驗。
1.2時間及地點實驗于2018年6至10月在西安交大醫學院實驗室完成。
1.3材料
1.3.1實驗動物40只SPF級BALB/c小鼠(6-8周齡)購于南方醫科大學實驗動物中心，許可證號SCXK(粵)2011-0015，單籠飼養，自然光照及飲水。
1.3.2實驗用主要試劑紅景天購于北京紅景天技術開發有限公司。鼠抗一抗PGC-1α抗體、Atg7抗體、LC3抗體、P62抗體軍購與美國CellSignaling公司。即用型SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒購于金斯瑞生物科技有限公司。RNAisoPlusreagent試劑盒購于美國R&D公司。
1.4實驗方法
1.4.1動物分組及運動強度計劃適應性喂養1周后，根據干預措施的不同，將小鼠隨機分為4組，每組10只。分別為：①空白對照組：采用生理鹽水2mL灌胃，自然飼養，不進行任何運動;②單純運動組：采用2mL生理鹽水灌胃后30min，將小鼠置于跑臺上進行大強度運動，時間約45min，坡度為0;第1周，起始速度設置為11m/min，每日遞增1m/min;第2周開始，每周遞增1m/min;③紅景天對照組：按照小鼠體質量，以100mg/(kg·d)為標準，將紅景天與生理鹽水配置成2mL懸濁液，運動前30min灌胃，常規飼養，不運動;④紅景天運動干預組：紅景天干預措施同紅景天對照組，運動方案同單純運動組。以上各組干預措施均為連續28d。運動方案：小鼠運動強度第1，2，3，4周分別為11-17，18，19，20m/min，第1周，每天遞增1m/min。
1.4.2前肢握力及力竭時間測試
(1)前肢握力測試[11]：在每個干預周的最后1d，采用Model-RX-5系統對4組小鼠的前肢握力進行檢測，檢測至少在灌胃開始前2h進行，以系統顯示的最大張力作為小鼠的最大前肢握力。
(2)力竭時間測試[12]：采用負重游泳訓練測試小鼠的力竭時間。將小鼠置于深約30cm的水槽中，保持水溫25℃左右，在尾部負荷約小鼠10%自身體質量的金屬條。從小鼠入水后開始計時，直至沉入水面下7s不浮出水面進行計算。力竭時間測試至少在灌胃開始前2h進行，且避開前肢握力測試當天。
1.4.3WesternBlot檢測骨骼肌錳超氧化物歧化酶蛋白、p53蛋白、線粒體起源、自噬啟動相關蛋白表達干預結束后處死小鼠，分離雙側腓腸肌，低溫凍存。檢測時，液氮研磨骨骼肌組織，裂解，提取總蛋白，BCA發測定蛋白濃度。電泳、轉膜、封閉、一抗二抗孵育、ECL法顯影定影。通過QuantityOne軟件分析條帶強度，以GAPDH為內參，檢測錳超氧化物歧化酶、p53蛋白、線粒體起源、自噬啟動相關蛋白(PGC-1α、Atg7、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62)表達。
1.4.4RT-qPCR檢測骨骼肌Mfn-1、Mfn-2、Opa-1、Drp-1、fis-1mRNA表達水平采用TRlzol法提取骨骼肌組織中的RNA，采用β-actin作為內參基因，參照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，利用SYBGGreen試劑盒進行RT-PCR反應。設計Mfn-1、Mfn-2、Opa-1、Drp-1、fis-1引物序列(表1)，反應條件為，50℃2min，95℃變性15s、30℃延伸30s，40個循環。基因相對表達水平采用2-∆∆Ct法確定。
1.5主要觀察指標①觀察小鼠的體質量、前肢握力、力竭時間;②骨骼肌細胞內錳超氧化物歧化酶、p53水平、骨骼肌內線粒體起源、自噬啟動相關指標蛋白(PGC-1α、Atg7、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62)、線粒體融合與分裂基因(Mfn-1、Mfn-2、Opa-1、Drp-1、fis-1)mRNA變化。
1.6統計學分析數據分析采用SPSS20.0軟件進行。計量資料采用x_±s表示，組間比較的統計分析采用重復因素方差分析檢驗，組間兩兩比較，方差齊則采用LSD法，方差不齊采用Dunnett法。P<0.05認為差異有顯著性意義。
2結果Results
2.1實驗動物數量分析實驗選用小鼠40只，實驗過程無脫失，全部進入結果分析。
2.2各組小鼠體質量變化在初始測量及干預的第1-3周，4組小鼠的體質量差異均無顯著性意義(P>0.05)，在第4周時，紅景天對照組小鼠體質量顯著高于單純運動組(P<0.05)。見表2。
2.3各組小鼠前肢握力比較4組小鼠在初始測量及干預第1周時的前肢握力差異無顯著性意義(P>0.05)。從第2周開始，單純運動組小鼠前肢握力顯著低于其他3組(P<0.05)，但空白對照組、紅景天對照組與紅景天運動干預組之間，小鼠前肢握力始終差異無顯著性意義(P>0.05)。見表3。
2.4單純運動組與紅景天運動干預組小鼠的力竭時間比較在第1，2周，單純運動組與紅景天運動干預組小鼠的力竭時間比較差異無顯著性意義(P>0.05)。第3周時，單純運動組與紅景天運動干預組的力竭時間分別為(583.61±47.28)s、(626.89±41.68)s，第4周時分別為(587.24±46.62)s、(638.78±38.15)s，差異均具有顯著性意義(P<0.05)。見表4。
2.5骨骼肌細胞內錳超氧化物歧化酶、p53水平比較Western-blot檢測結果顯示，單純運動組小鼠骨骼肌細胞內的錳超氧化物歧化酶、p53水平顯著高于其他組小鼠(P<0.05)。與紅景天對照組比較，紅景天運動干預組小鼠骨骼肌細胞內的錳超氧化物歧化酶、p53水平也顯著較高(P<0.05)。見表5。
2.6紅景天對骨骼肌內線粒體起源、自噬啟動相關指標影響與空白對照組相比，紅景天對照組小鼠骨骼肌內PGC-1α、Atg7、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62水平均無明顯差異;單純運動組小鼠骨骼肌內PGC-1α、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平明顯升高，Atg7、P62水平顯著下降(P<0.05)。與紅景天對照組相比，紅景天運動干預組4項指標水平差異均有顯著性意義(P<0.05)。見表6。
2.7紅景天對骨骼肌內線粒體融合-分裂相關指標的影響與空白對照組相比，單純運動組小鼠的線粒體融合基因(Mfn-1、Mfn-2、Opa-1)mRNA表達水平均明顯下降(P<0.05)、分裂基因Drp-1mRNA表達水平明顯上升(P<0.05)，紅景天運動干預組的融合基因mRNA表達也呈下降趨勢，Drp-1mRNA表達水平呈上升趨勢，但差異無顯著性意義(P>0.05)。見表7。
相關期刊推薦：《中國組織工程研究》雜于1997年創辦，發表組織工程研究中關于干細胞培養與移植、組織構建、材料生物相容性評價(天然或合成材料與納米粒子、人工材料植入體、植入器官及外源性細胞)、計算機輔助骨外科技術的應用基礎及臨床研究，轉化醫學和循證醫學研究的文章，發表中國組織工程研究領域一流水平的學術、技術創新成果。
3討論Discussion
骨骼肌是影響機體耐力的關鍵組織，適當的有氧運動可刺激肌纖維強壯增粗。而短時間的大強度運動會通過氧化應激、脂質過氧化等機制，破壞體內氧化/抗氧化系統的平衡，造成各種氧化過程的產物或衍生物大量堆積，抑制骨骼肌線粒體功能，使運動耐力下降[13-16]。
在此次研究中，從第2周開始，單純運動組小鼠前肢握力顯著低于其他3組，但空白對照組、紅景天對照組與紅景天運動干預組之間，小鼠前肢握力始終無明顯差異;同時，在第3周及第4周時，單純運動組的力竭時間明顯短與紅景天運動干預組。這表明，不恰當的運動量會對肌肉的力量及持久力造成損害，而紅景天則對這種傷害表現出了一定的保護作用。這與Zhu等[17]研究的結論一致，研究者檢測了血清超氧化物歧化酶及丙二醛水平，結果發現，大運動量小鼠的超氧化物歧化酶及丙二醛水平顯著升高，而通過紅景天干預，可有效減少相關酸性產物水平，表明紅景天可減少肌組織脂質過氧化水平。降低活性氧水平、改善超氧化物歧化酶活性是紅景天保護受損內皮細胞的重要機制。大強度運動會造成極易氧自由基大量堆積，誘導脂質發生過氧化，造成骨骼肌纖維損傷。而在補充紅景天之后，實驗小鼠的抗氧化能力明顯加強，氧化損傷程度變小，線粒體相關的運動性疲勞也得到有效緩解。
錳超氧化物歧化酶是超氧化物歧化酶分子內所含金屬離子Mn2+，主要存在于機體的線粒體中，主要發揮著祛除過剩的超氧自由基及抑制癌基因的作用[18-20]。p53是一個重要的抗癌基因，同時還具有協助細胞基因修復缺陷的功能[21-24]。Western-blot檢測發現，單純運動組小鼠骨骼肌細胞內的錳超氧化物歧化酶、p53水平顯著高于其他組小鼠(P<0.05)。與紅景天對照組比較，紅景天運動干預組小鼠骨骼肌細胞內的錳超氧化物歧化酶、p53水平也顯著較高。這表明，大運動量小鼠體內存在著明顯的氧化應激反應。進一步檢測發現，與空白對照組相比，單純運動組小鼠骨骼肌內PGC-1α、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平明顯升高，Atg7、P62水平顯著下降，與紅景天對照組相比，紅景天運動干預組4項指標水平均存在顯著差異。這表明，短期內大運動量會抑制小鼠體內線粒體起源，同時誘發線粒體發生自噬。線粒體發生于線粒體自噬是控制線粒體質量的主要環節[25-27]。不同于一般體細胞，骨骼肌中的線粒體可通過自噬過程完成損傷線粒體的清除與更新，從而維持呼吸鏈的穩定平衡。一旦發生傷害性骨骼肌運動，線粒體可啟動自噬過程清除異常線粒體，防止堆積，但同時也會造成肌肉功能不同程度的損傷。
“融合-分裂”是線粒體維持動態平衡的另一項重要機制，其中涉及的分子眾多，形成復雜的調控網絡[28-30]。當不良刺激超出線粒體代償能力時，融合基因表達量會出現顯著下降，在此次研究中，與空白對照組相比，單純運動組小鼠的線粒體融合基因mRNA表達水平均明顯下降、分裂基因Drp-1mRNA表達水平明顯上升，紅景天運動干預組的融合基因mRNA表達也呈下降趨勢，Drp-1mRNA表達水平呈上升趨勢，但差異無統計學意義。這表明，短期內大運動量會導致骨骼肌線粒體“融合-分裂”過程失衡，并影響線粒體功能。而紅景天可通過調節線粒體“融合-分裂”過程，調節線粒體功能，減輕運動損傷。
綜上所述，研究發現，紅景天可顯著提高大強度運動量小鼠的運動耐力，這可能與改善了骨骼肌線粒體自噬、起源及線粒體融合-分裂有關。
SCISSCIAHCI
