發(fā)布時(shí)間：2020-02-17所屬分類：醫(yī)學(xué)職稱論文瀏覽：1次
摘 要： [摘 要]目的: 建立一種快速、準(zhǔn)確的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法( UPLC-MS /MS) ，用于臨床上測(cè)定人血清中氯氮平、N-去甲基氯氮平、喹硫平、阿立哌唑及齊拉西酮 5 種常用的非典型抗精神病藥物的血藥濃度。方法: 以氯氮平-d3、喹硫平-d8、阿立哌唑-d8 和齊拉西酮
[摘 要]目的: 建立一種快速、準(zhǔn)確的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法( UPLC-MS /MS) ，用于臨床上測(cè)定人血清中氯氮平、N-去甲基氯氮平、喹硫平、阿立哌唑及齊拉西酮 5 種常用的非典型抗精神病藥物的血藥濃度。方法: 以氯氮平-d3、喹硫平-d8、阿立哌唑-d8 和齊拉西酮-d8 穩(wěn)定同位素為內(nèi)標(biāo)，血清樣品經(jīng)過前處理后采用 UPLCMS /MS 對(duì)上清液進(jìn)行分析。結(jié)果: 空白血清對(duì)藥物的檢測(cè)無干擾，氯氮平、N-去甲基氯氮平、喹硫平、阿立哌唑及齊拉西酮在 1. 00 ～ 1 000 μg /L 范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù) r > 0. 998 8; 日內(nèi)、日間精密度( RSD) 均小于 15% ，回收率 90% ～ 110% ; 樣品在室溫 12 h、4 ℃冰箱 48 h、自動(dòng)進(jìn)樣器 24 h 及反復(fù)凍融 3 次的情況下都能保持穩(wěn)定。結(jié)論: 本方法前處理操作簡(jiǎn)單，能夠快速、準(zhǔn)確、高通量地檢測(cè)所選擇的 5 種非典型抗精神病藥物的血藥濃度。
[關(guān)鍵詞]超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜; 血藥濃度; 非典型抗精神病藥物; 血清; 同位素內(nèi)標(biāo)
治 療 藥 物 監(jiān) 測(cè) ( therapeutic drug monitoring， TDM) 是運(yùn)用現(xiàn)代分析技術(shù)，測(cè)定血液或其他體液中的藥物及其代謝物的濃度，并根據(jù)藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)理論分析并制定最佳給藥方案，從而達(dá)到安全合理用藥的目的[1 - 4]。精神分裂癥是一種病因復(fù)雜，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變有關(guān)的疾病，長(zhǎng)期應(yīng)用抗精神病類藥物治療可能產(chǎn)生嚴(yán)重的錐體外系癥狀 ( EPSs) ，目前非典型抗精神病藥已經(jīng)成為主要的抗精神病藥物[5 - 9]。因此，對(duì)于抗精神病類藥物而言，測(cè)定血漿或血清中藥物濃度實(shí)現(xiàn)個(gè)體化給藥，能夠獲得最佳的療效、更好的耐受性，同時(shí)還可以降低中毒的風(fēng)險(xiǎn)[10]，為達(dá)到這一目的，本研究參考文獻(xiàn)[11 - 14]，采用超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法( UPLC -MS /MS) 同時(shí)檢測(cè) 5 種非典型抗精神病類藥物的血藥濃度，報(bào)告如下。
1 材料與方法
1. 1 儀器
Waters Acquity UPLC-TQ-D 型液質(zhì)聯(lián)用儀( 美國(guó)，Waters 公司) ，H1650R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) ( 中國(guó)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司) ，BT125D 電子天平( 德國(guó)，賽多利斯股份公司) ，G560E 渦旋混合器( 美國(guó)，Scientific Industries 公司) 。
1. 2 試藥
氯氮平購自 Sigma( 美國(guó)) ，阿立哌唑購自中國(guó)食品藥品檢定研究院，喹硫平、齊拉西酮、氯氮平- d3、喹硫平-d8 和齊拉西酮-d8 購自 Toronto research chemicals Inc( 加拿大) ，N-去甲基氯氮平、阿立哌唑-d8 購自 cerilliant( 美國(guó)) ，色譜甲醇、乙腈購自默克公司( 德國(guó)) ，屈臣氏蒸餾水購自廣州屈臣氏食品飲料有限公司。
1. 3 色譜及質(zhì)譜條件
1. 3. 1 色譜條件 色譜柱 Acquity UPLC BEH C18 IVD ( 2. 1 mm ×50 mm，1. 7 μm) ，柱溫50 ℃，進(jìn)樣量 5 μL，流速 0. 5 mL /min。流動(dòng)相: 0. 1% 甲酸水溶液 ( A) ，0. 1% 甲酸甲醇溶液 ( B) ，梯度洗脫，0 ～ 0. 5 min 使用 20% B，0. 5 ～ 1. 3 min 使用 20% ～ 80% B，1. 3 ～ 1. 7 min 使用 80% ～ 95% B，1. 7 ～ 1. 75 min 使用 95% ～ 20% B; 1. 75 ～ 2. 0 min 使用 20% B。 +
1. 3. 2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，正離子模式; 毛細(xì)管電壓 3. 0 kV，脫溶劑氣溫度( TEM) 500 ℃，脫溶劑氣流( L /Hr) 800，錐孔氣流( L /Hr) 50，掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)( MRM) 。常見非典型抗精神病藥物質(zhì)譜參數(shù)見表 1。
1. 4 樣品處理及標(biāo)準(zhǔn)液的配制
1. 4. 1 樣品處理 取血清樣品 100 μL 置 1. 5 mL EP 管中，加入 400 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混合 3 min，于 4 ℃ 11 000 r/min 離心 15 min; 取 300 μL 上清液置于另一個(gè) 1. 5 mL EP 中，4 ℃ 11 000 r/min 離心 15 min，取 100 μL 上清液置于 96 孔板中，進(jìn)樣 5 μL進(jìn)行分析。
1. 4. 2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取各標(biāo)準(zhǔn)品 10 mg分別置于 10 mL 量瓶中，用純甲醇溶解并定容至刻度，得到濃度為 1. 0 g /L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液。將各標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液用甲醇稀釋 10 倍得到濃度為 100 mg /L 的各標(biāo)準(zhǔn)溶液工作液，分別吸取各標(biāo)準(zhǔn)溶液工作液 100 μL 置 1. 5 mL 的 EP 管中，渦旋混勻，得到濃度為 10 mg /L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液; 用空白血清稀釋成濃度分別為 1 000、500、250、100、 50、25、10、5、2. 5 及 1 μg /L 的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。內(nèi)標(biāo)的配制: 將濃度為 100 mg /L 的內(nèi)標(biāo)溶液儲(chǔ)備液用甲醇稀釋成濃度為 25 μg /L 的內(nèi)標(biāo)工作液，保存于 - 80 ℃冰箱。
1. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
數(shù)據(jù)處理采用 MassLynx V4. 2 軟件，數(shù)據(jù)分析采用 Excel 軟件計(jì)算均值( x) 、標(biāo)準(zhǔn)偏差( S) 和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差( RSD% ) ，數(shù)據(jù)結(jié)果采用( x ± s) 表示，日內(nèi)、日間精密度用 RSD% 進(jìn)行評(píng)價(jià)。
2 結(jié)果
2. 1 線性和定量下限考察
按照 1. 4. 2 項(xiàng)下步驟配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線及1. 4. 1 項(xiàng)下操作對(duì)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行處理，以各藥物的濃度為橫坐標(biāo)，以各藥物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程; 同時(shí)，用空白血清配制濃度為 1. 0 μg /L 的各藥物的定量下限樣品。結(jié)果表明，各藥物在線性范圍內(nèi)線性良好，各藥物的線性范圍和線性方程及相關(guān)系數(shù)見表 2; 各藥物在定量下限 1. 0 μg /L 處的響應(yīng)良好( 見圖 1) ，精密度小于 15% ( 見表 3) 。
2. 2 日內(nèi)、日間精密度和回收率
用空白血清制備低、中、高濃度的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度質(zhì)控樣品取 6 份測(cè)定作為日內(nèi)精密度，連續(xù)檢測(cè) 3 天獲得的結(jié)果作為日間精密度。向空白血清中加入低、中、高濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度各取 6 份，通過計(jì)算檢測(cè)值與加入的標(biāo)準(zhǔn)品的比值，取平均值得到回收率。結(jié)果表明，各藥物的日內(nèi)、日間精密度( RSD% ) 均 小于 15% ; 平均回收率在 90% ～ 110% 。見表 4。
2. 3 穩(wěn)定性
用空白血清制備低、高濃度的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度各取 6 份，考察各藥物低、高兩個(gè)濃度在室溫、 4 ℃冰箱、自動(dòng)進(jìn)樣器以及 3 次反復(fù)凍融時(shí)的穩(wěn)定性。室溫考察的時(shí)間點(diǎn)包括 0、8 及 12 h，4 ℃ 冰箱考察的時(shí)間點(diǎn)包括 0、12、24 及 48 h，自動(dòng)進(jìn)樣器考察的時(shí)間點(diǎn)包括 0 及 24 h。結(jié)果表明，各藥物在考察的條件下均保持穩(wěn)定。見表 5。
3 討論
精神疾病是近年來多發(fā)的病因不明的疾病之一，精神疾病患者給家庭帶來很大的經(jīng)濟(jì)壓力和心理壓力，已經(jīng)越來越受到醫(yī)護(hù)人員和相關(guān)人員的極大關(guān)注。傳統(tǒng)治療藥物監(jiān)測(cè)技術(shù)，例如基于光譜學(xué)、免疫抗體學(xué)等臨床檢測(cè)技術(shù)，具有定性定量特征信息單一的弱點(diǎn)，抗干擾能力差; 目前國(guó)內(nèi)對(duì)抗精神類藥物進(jìn)行的血藥濃度監(jiān)測(cè)主要運(yùn)用反相高效液相色譜法[15 - 17]，在靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性方面與液質(zhì)聯(lián)用( LC-MS /MS) 法存在較大差距，且前處理過程復(fù)雜、分析時(shí)間過長(zhǎng)[18 - 20]。LC-MS /MS 具有更高的靈敏度和特異性，并且可以實(shí)現(xiàn)多組分同時(shí)分析，具有更高的檢測(cè)通量，在臨床檢測(cè)中表現(xiàn)出較大的優(yōu)勢(shì)[21]。本文建立 LC-MS /MS 方法中各藥物在 1. 0 ～ 100 0 μg /L 范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)( r) 均大于 0. 998 8; 各藥物在定量下限 1. 0 μg / L 處的響應(yīng)良好，精密度小于 15% ; 日內(nèi)、日間精密度均小于 15% ; 平均回收率在 90% ～ 110% ，樣品穩(wěn)定性良好。楊春霞[17]等的研究中前處理步驟采用乙醚萃取，再將乙醚真空揮干后復(fù)溶，操作復(fù)雜，本研究前處理過程僅需甲醇蛋白沉淀一個(gè)步驟，大大簡(jiǎn)化了前處理過程; Dongeun Park 等[11]的研究中液相分離時(shí)間為 11 min，本研究中將時(shí)間縮短到 2 min，大大縮短檢測(cè)時(shí)間; 同時(shí)本研究使用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，與國(guó)內(nèi)外已有的方法相比本研究的方法在前處理過程，檢測(cè)時(shí)間和準(zhǔn)確性等方面都有明顯優(yōu)勢(shì)
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