發布時間：2020-02-17所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要:文中建立了在線固相萃取/液相色譜三重串聯四極桿質譜(on-lineSPE/LC-MS/MS)方法同時測定血液和尿液中10種巴比妥類藥物。樣品用乙腈沉淀蛋白，經在線固相萃取柱(HLB)富集純化，以Poroshell120EC-C18柱(2.1mm50mm，1.9m)為分析柱，乙腈水為流動相進行梯度
摘要:文中建立了在線固相萃取/液相色譜—三重串聯四極桿質譜(on-lineSPE/LC-MS/MS)方法同時測定血液和尿液中10種巴比妥類藥物。樣品用乙腈沉淀蛋白，經在線固相萃取柱(HLB)富集純化，以Poroshell120EC-C18柱(2.1mm×50mm，1.9μm)為分析柱，乙腈—水為流動相進行梯度洗脫。電離模式為電噴霧電離負模式(ESI-)，掃描方式為多反應監控模式(MRM)，定量方法采用外標法。結果表明，10種化合物在各自質量濃度范圍內線性關系良好(權重因子1/x)，相關系數為0.9988～0.9995，方法檢出限(MDL)和定量限(LOQ)分別為10.0～20.0ng/mL和20.0～50.0ng/mL，回收率為95.8%～109.5%，相對標準偏差(RSD)為0.5%～3.8%(n=6)。檢測方法操作簡單，耗時短，檢測靈敏度高且結果準確，能夠滿足血液和尿液樣品中10種化合物同時快速篩查和準確定量。
關鍵詞:在線固相萃取;液相色譜—串聯質譜;巴比妥類;生物樣品
0引言
巴比妥類藥物是一類作用于中樞神經系統的鎮定劑，在臨床上的應用范圍廣泛，除鎮靜麻醉作用以外，還可以用作抗焦慮藥、安眠藥、抗痙攣藥。此類藥物具有成癮性，而且，由于其應用廣泛，較易獲得，易被不法分子用于犯罪，導致自殺、他殺、過量服用中毒等刑事案件的發生。目前有關檢測生物樣品中巴比妥類藥物的文獻較少，因此，急需建立測定生物樣品中巴比妥類藥物的方法，為臨床救治和法醫毒物分析提供技術支持。
目前測定生物樣品中巴比妥類藥物的方法有氣相色譜法(GC)[1]、氣相色譜—質譜聯用法(GC-MS)[2-3]、氣相色譜—串聯質譜法(GC-MS/MS)[4-5]、液相色譜—飛行時間質譜法[6]和液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[6-9]等。氣相色譜法專屬性較差，難以滿足毒物分析特異性強、定性準確的要求。氣相色譜—質譜聯用法檢測巴比妥類藥物靈敏度低，常需要衍生化，前處理過程繁瑣而且耗時。液相色譜—質譜聯用技術因具有靈敏度高、分析范圍廣和分析時間短等特點，近年來在毒物分析領域中有著廣泛的應用。
相關期刊推薦：《廣西大學學報(自然科學版)》(雙月刊)創刊于1976年，是廣西大學主管、主辦的綜合性學術理論期刊。主要刊登有關數學、物理、化學、計算機科學、機械、電氣、土木、化工、輕工、礦冶等理工科各專業有關基礎科學和應用科學的科研論文和綜述評論等。內容以綜合性和學術性為特點。讀者對象為科技工作者和大專院校理工科師生。
目前，生物樣品的前處理方法有液液萃取法(LLC)[1，7-9]、液相微萃取法(LPMC)[3]、固相微萃取法(SPMC)[2]、離線固相萃取法(SPE)[4-6]，等。液液萃取法、液相微萃取法、固相微萃取法和離線固相萃取法作為前處理方法，其操作繁瑣，耗時較長，而且成本高。在線固相萃取，其操作自動化程度高、樣品用量少、速度快、重復性好，且在線SPE柱可重復使用，而且成本低，是一種經濟實惠且綠色環保的前處理手段。作者所在課題組前期已使用在線固相萃取作為前處理方法開發了一系列藥物分析方法[10-13]。本文在前期的實驗基礎上建立了在線固相萃取/液相色譜—三重四級桿串聯質譜法(on-lineSPE/LCMS/MS)，以同時快速檢測血液和尿液中10種巴比妥類藥物。該方法樣品前處理自動化程度高、操作簡單、分析快速、檢測靈敏度高、結果準確，可滿足血液和尿液痕量巴比妥類藥物的篩查要求。
1實驗材料與方法
1.1儀器與試劑
1260液相色譜分離系統(美國安捷倫科技公司)，包括1260InfinityBin二元高壓泵(G1312B)、1260InfinityHip脫氣機(G4275A)和1290InfinityTCC柱溫箱(G1316C)。
1260在線固相萃取系統(on-lineSPE)(美國安捷倫科技公司)，包括1260Infinity自動進樣器(G7167A)、1260Infinity四元泵(G1311B)，內置脫氣機(G1311-64065)。
6470三重四極桿質譜聯用儀(MS/MS)(美國安捷倫科技公司)，配噴射流電噴霧離子源(AJSESI)、MassHunter工作站軟件。
3-18R高速冷凍離心機(美國TOMOS公司);SB3200-HT超聲波清洗器(必能信上海有限公司);Master-sUV超純水發生器(上海和泰儀器有限公司)。
用十通閥將在線固相萃取系統與液相色譜分離系統進行連接，通過閥的切換使樣品進行在線富集和分析，具體連接方式見圖1。
巴比妥(Barbital，98.9%)、戊巴比妥(Pentobarbitone，99.5%)、異戊巴比妥(Amobarbital，98.6%)、苯巴比妥(Phenobarbital，99.1%)、甲苯巴比妥(Methylphenobarbital，98.9%)、司可巴比妥(Secobarbital，99.8%)、硫噴妥(Pentothal，99.6%)、仲丁巴比妥(Butabarbital，99.5%)、環己巴比妥(Cyclobarbital，99.8%)和布他比妥(Butalbital，99.8%)購自Sigma公司;甲醇、乙腈為質譜純(美國Fisher公司);甲酸、乙酸銨、氨水為色譜純(美國Fisher公司);實驗用水為超純水。
準確稱取10種巴比妥類藥物標準品，用乙腈溶解，定容，配制成1.0mg/mL的單個標準儲備液，于-4℃保存。使用時根據所需濃度，用乙腈稀釋配制成不同質量濃度的單個標準工作液和混合標準工作液。
空白血液和尿液均來自身體健康的志愿者。
1.2在線固相萃取和液相色譜條件
在線SPE條件:SPE柱為WatersOasisHLB(20mm×3.9mm，5μm);流動相A為水;流動相B為甲醇;流動相C為乙腈。
液相色譜條件:分析柱為安捷倫Poroshell120EC-C18(2.1mm×50mm，1.9μm);流動相A為水;流動相B為乙腈;柱溫40℃;進樣量50μL;液相梯度洗脫條件及十通閥切換時間見表1。
1.3MS-MS質譜參數
離子化模式為負模式(ESI-);掃描類型為多反應監測(MRM);鞘氣溫度250℃;鞘氣流量12mL/min;霧化器壓力35psi;毛細管電壓3500V(正極)，2500V(負極);噴嘴電壓500V;干燥氣流量6mL/min;干燥氣溫度300℃;MRM總數20;循環時間500ms。
1.4樣品處理
分別吸取1.0mL血液和尿液于5mL試管中，加入3.0mL乙腈，渦旋振蕩1min，以10000r/min離心10min，吸取1.0mL上清液，加入2.25mL乙酸銨水溶液(0.01mol/L)，渦旋振蕩1min，過0.22μm濾膜，供LC-MS分析。
2結果與討論
2.1質譜條件優化
對10種藥物進行一級ESI+、ESI-電離模式考察，結果10種化合物僅在ESI-模式下有響應，均形成[M—H]-離子。利用儀器Optimizer質譜自動優化軟件對10種化合物的[M—H]-離子碎裂電壓、碎片離子碰撞能量等質譜條件進行自動優化。根據自動優化結果，選取響應強度相對較高的兩對離子對分別作為定量離子對和定性離子對。甲苯巴比妥和環己巴比妥的[M—H]-離子只電離得到一個子離子碎片，既是定量離子也是定性離子，優化后的各化合物質譜參數見表2。
2.2流動相的選擇
以Poroshell120EC-C18(2.1mm×50mm，1.9μm)作為分析柱，分別對中性—乙腈—水、中性—乙腈-0.01mol/L乙酸銨水溶液、酸性—乙腈—水(含0.1%甲酸)、酸性—乙腈-0.01mol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)、中性—甲醇—水、酸性—甲醇—水(含0.1%甲酸)、中性—甲醇-0.01mol/L乙酸銨水溶液和酸性—甲醇-0.01mol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)等8種體系流動相(分別為圖2中的a，b，c，d，e，f，g和h)進行了考察，得到這8種流動相下的響應值，結果表明，當流動相有甲酸和乙酸銨時，兩者均產生離子抑制作用，化合物的響應降低;以中性—乙腈—水和中性—甲醇—水作為流動相時，10種化合物的響應更好。兩者相比較，中性—乙腈—水作為流動相時，10種化合物的分離效果和峰形更好。因此，實驗選擇中性乙腈—水為流動相，10種化合物的多反應監控(MRM)色譜圖見圖3。
2.3樣品稀釋液的酸堿性對萃取效率的影響
本文中的生物樣品用乙腈沉淀蛋白后，其基質液中乙腈含量較高，對On-lineSPE的萃取效率和色譜峰形有不利的影響，因此需要對基質液進行稀釋。本研究考察了酸性(0.01mol、L含0.1%甲酸的乙酸銨溶液，pH4.8)、中性(0.01mol/L乙酸銨溶液，pH7.0)和堿性(氨水-0.01mol/L乙酸銨溶液，pH9.2)3種緩沖稀釋液對SPE柱萃取效果的影響。結果表明，SPE柱在酸性和中性條件下均能萃取到10種化合物，兩者相比較，中性條件下萃取效果最好，10種化合物的分離效果也最好，峰形好且靈敏度高;堿性條件下萃取效果和分離效果均較差。因此，選取0.01mol/L乙酸銨水溶液(pH7.0)為樣品的稀釋液。
2.4方法的線性范圍、檢出限、定量限、回收率及精密度
用空白血液和尿液，逐級添加混合標準工作溶液，得到0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0、800.0、1000.0ng/mL系列濃度，按“1.4”節樣品處理方法進行處理，每個質量濃度重復測定6次以確定方法的精密度。以10種化合物的質量濃度x(ng/mL)為橫坐標，峰面積y為縱坐標建立標準工作曲線(權重因子1/x)，以回收率為80%～120%、相對標準偏差(RSD)≤15%(n=6)的加標濃度作為定量限(LOQ)，以定性離子對信噪比(S/N)≥3的加標濃度作為方法的檢出限(MDL)。10種化合物在各相對應質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數為0.9988～0.9995，方法檢出限(MDL)和定量限(LOQ)分別為10.0～20.0ng/mL和20.0～50.0ng/mL，結果見表3;定量限以上、線性范圍內添加水平的回收率為95.8%～109.5%，相對標準偏差(RSD)為0.5%～3.8%(n=6)，結果見表4。
3、結語本
研究建立了在線固相萃取作為前處理技術、結合液相色譜—三重串聯四極桿質譜同時快速測定血液和尿液中10種巴比妥類藥物的方法。樣品經乙腈沉淀蛋白和在線SPE柱富集純化后進行三重串聯四極桿質譜檢測分析。該方法操作簡便省時、靈敏度高、結果準確、重現性好。在線SPE作為前處理方法，其自動化程度高，操作簡單，大大縮短了前處理時間，減小了基質干擾，提高了檢測分析的質量，為臨床救治和法醫毒物分析提供了有效的技術手段。
SCISSCIAHCI
