發(fā)布時間：2016-05-18所屬分類：醫(yī)學論文瀏覽：1次
摘 要： 論文摘要：軟骨退變是OA的主要病理特征，是多因素綜合作用引起的軟骨細胞、軟骨基質(zhì)及軟骨下骨降解與合成偶聯(lián)失衡的結(jié)果。膠原和蛋白多糖是軟骨細胞外基質(zhì)的主要成分，Ⅱ型膠原是軟骨基質(zhì)的特征性膠原成分，構(gòu)成軟骨內(nèi)的纖維網(wǎng)架結(jié)構(gòu);蛋白多糖能吸引大量的水
論文摘要：軟骨退變是OA的主要病理特征，是多因素綜合作用引起的軟骨細胞、軟骨基質(zhì)及軟骨下骨降解與合成偶聯(lián)失衡的結(jié)果。膠原和蛋白多糖是軟骨細胞外基質(zhì)的主要成分，Ⅱ型膠原是軟骨基質(zhì)的特征性膠原成分，構(gòu)成軟骨內(nèi)的纖維網(wǎng)架結(jié)構(gòu);蛋白多糖能吸引大量的水分子形成凝膠，保持軟骨的膨脹能力和良好彈性。本文選自：《中國傷殘醫(yī)學》的原名是《傷殘醫(yī)學雜志》，《傷殘醫(yī)學雜志》創(chuàng)刊于1993年，原衛(wèi)生部陳敏章部長、顧英奇副部長為創(chuàng)刊題詞，在有關(guān)領(lǐng)導、各位編委、專家、作者、讀者及廣大醫(yī)務工作者大力支持和幫助下，學術(shù)水平和編校質(zhì)量不斷提高，2006年經(jīng)國家新聞出版署批準，更名為《中國傷殘醫(yī)學》，由衛(wèi)生部主管，本刊由省級升格為國家級期刊。
引言
骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種以軟骨退變、骨質(zhì)增生及軟骨下骨重建異常為特征的慢性骨關(guān)節(jié)病，易反復發(fā)作，纏綿難愈。隨著年齡增加發(fā)病率逐漸增加，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，已成為嚴重的公共健康問題[1-2]。目前，OA治療方法雖多，但主要以對癥治療為主，尚缺乏特效療法。為此，尋找一種經(jīng)濟、方便、無創(chuàng)的有效療法，成為醫(yī)學界的共識。
中藥復方治療OA具有療效可靠、價格低廉、副作用小的獨特優(yōu)勢。補腎壯筋湯是《傷科補要》中治療肝腎虧虛型OA的經(jīng)典方，具有補益肝腎、強壯筋骨作用[3]，療效顯著。本研究以OA大鼠動物模型為研究對象，探討補腎壯筋湯抑制OA軟骨退變的作用機制。
1 實驗材料
1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠40只，8周齡，雄性，體質(zhì)量220～250 g，上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供合格證號：SCXK(滬)2007-0005。福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供清潔級實驗動物環(huán)境設施(合格證號：醫(yī)動學第23-016號)。實驗動物的處置按照2006年科技部《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》規(guī)定。
1.2 藥品、試劑與儀器 補腎壯筋湯(藥物組成：熟地黃12 g、當歸12 g、牛膝10 g、山萸肉12 g、茯苓12 g、續(xù)斷12 g、杜仲10 g、白芍10 g、青皮5 g、五加皮10 g)由福建中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂提供;鹽酸氨基葡萄糖膠囊，批號HC20090009，香港澳美制藥廠生產(chǎn)。質(zhì)量分數(shù)10%水合氯醛，批號SF0341，上海士鋒生物科技有限公司生產(chǎn);木瓜蛋白酶，批號107147，sigma公司生產(chǎn);蘇木精-伊紅(HE)，批號 G1120，北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn);番紅O-固綠，批號DB0082，北京雷根生物技術(shù)有限公司生產(chǎn);基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)，批號fk1653Y，白細胞介素-1β(IL-1β)，批號fk1588Y，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，批號fk1721Y，透明質(zhì)酸(HA)，批號fk2052Y，上海滬宇生物科技有限公司生產(chǎn)。ELX808U型酶標儀，美國寶特公司生產(chǎn);TGL-16G型離心機，上海安亭科學儀器廠生產(chǎn)。
2 方 法
2.1 補腎壯筋湯水提物制備 取干燥、粉碎的補腎壯筋湯方藥粉末105 g，加入1 050 mL的蒸餾水，提取2次，每次2.5 h，趁熱過濾，濃縮，50 ℃真空干燥至恒重。
2.2 實驗方法 SD大鼠40只，按隨機數(shù)字表法分為正常組(10只)和造模組(30只)。造模組第1，4，7天，采用質(zhì)量分數(shù)10%水合氯醛3 mL·kg-1
腹腔麻醉，采用質(zhì)量分數(shù)4%木瓜蛋白酶0.2 mL雙膝關(guān)節(jié)腔注射建立OA模型[4]。造模2周后按隨機數(shù)字表法分為模型對照組、補腎壯筋湯組、陽性對照組，每組10只。各組給藥劑量按照人和動物藥物等效劑量換算[5]，已知A種動物每千克體質(zhì)量用藥量，求出B種動物每千克體質(zhì)量用藥劑量的換算公式，B種動物的劑量(mg)= A種動物的劑量(mg·kg-1)×
W(折算系數(shù)6.25)×B種動物的體質(zhì)量(kg)。正常組常規(guī)喂養(yǎng)，模型對照組以等量生理鹽水灌胃，補腎壯筋湯組以補腎壯筋湯10.5 g·kg-1·d-1
灌胃，陽性對照組予以鹽酸氨基葡萄糖膠囊溶液
150 mg·kg-1·d-1灌胃，每日1次，持續(xù)給藥12周。干預12周后，取雙膝關(guān)節(jié)股骨髁，質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫鈣、包埋和切片，分別采用HE、番紅O-固綠染色，觀察軟骨組織形態(tài)的變化。參考Mankin's OA組織學分級方法進行評分[6]。軟骨退變程度計分依據(jù)表層軟骨細胞分裂增生(0～3分)、細胞排列(0～3分)、潮線(0～3分)、血管翳樣物生成(0～3分)、AB-PAS染色(0～4分)，最高為16分。
2.3 檢測方法
2.3.1 HE染色 切片常規(guī)脫蠟，蘇木精染液染色4 min，質(zhì)量分數(shù)1%鹽酸酒精分化液分色10 s，伊紅染液染色3 min，脫水透明封片，觀察軟骨形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。
2.3.2 番紅O-固綠染色 切片常規(guī)脫蠟，新鮮配制的試劑，Weigert蘇木素染液染色3 min，鹽酸乙醇分化液分化15 s，蒸餾水洗1 min;固綠染色液內(nèi)浸染5 min，蒸餾水洗1 min;番紅O染色液內(nèi)浸染
2 min，蒸餾水洗1 min;用乙酸溶液洗滌切片1 min，脫水透明封片，觀察軟骨基質(zhì)蛋白多糖含量的變化。
2.3.3 ELISA法檢測關(guān)節(jié)液的生化指標 采用質(zhì)量分數(shù)10%水合氯醛3 mL·kg-1腹腔麻醉，抽取雙膝關(guān)節(jié)液。抽取前先注射2 mL生理鹽水，反復活動膝關(guān)節(jié)后，抽取0.8 mL關(guān)節(jié)液，-80 ℃保存。關(guān)節(jié)液中MMP-3、IL-1β 、TNF-α、HA含量采用ELISA法檢測。檢測過程嚴格按照試劑說明書的操作步驟，標準曲線的相關(guān)系數(shù)為0.995。
2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS l3.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，多組數(shù)據(jù)之間比較采用單因素方差分析，兩組數(shù)據(jù)之間比較采用t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
3 結(jié) 果
3.1 補腎壯筋湯抑制OA的軟骨退變 正常組軟骨表面光滑平整，四層結(jié)構(gòu)清晰，軟骨細胞排列整齊，潮線清晰完整，軟骨下骨的骨小梁密度和寬度適中，排列規(guī)律，骨細胞呈梭形，分布均勻，見圖1(1)、圖1(2)。模型對照組軟骨表面粗糙，四層結(jié)構(gòu)不清晰，軟骨細胞排列紊亂，潮線模糊、多重或中斷，軟骨下骨囊變、骨小梁稀疏，見圖1(3)、圖1(4)。補腎壯筋湯組、陽性對照組軟骨、軟骨下骨的改變，介于正常組與模型對照組之間，見圖1(5)、圖1(6)、圖1(7)、圖1(8)。
3.2 補腎壯筋湯抑制軟骨基質(zhì)的蛋白多糖含量減少和纖維變性 正常組軟骨基質(zhì)中蛋白多糖呈現(xiàn)紅染，膠原纖維呈綠色，軟骨下骨的骨小梁呈綠色，見圖2(1)、圖2(2)。模型對照組軟骨基質(zhì)中蛋白多糖呈淡紅色，染色范圍減少，而綠色范圍增大，提示軟骨基質(zhì)中蛋白多糖含量減少，纖維成分增多，見圖2(3)、圖2(4)。補腎壯筋湯組、陽性對照組軟骨基質(zhì)中蛋白多糖與膠原纖維的變化，明顯好于模型對照組，見圖2(5)、圖2(6)、圖2(7)、圖2(8)。
3.3 補腎壯筋湯降低OA軟骨退變的程度 軟骨Mankin's評分，模型對照組(11.17±2.32)分、補腎壯筋湯組(8.50±2.07)分與陽性對照組(8.33±
1.63)分，明顯高于正常組的(1.83±0.75)分，補腎壯筋湯組
陽性對照組明顯低于模型組(P < 0.05)，補腎壯筋湯組與陽性對照組差異無統(tǒng)計學意義
(P > 0.05)，見圖3。
注 與正常組比較，1)P < 0.01;與模型對照組比較，
2)P < 0.05
3.4 補腎壯筋湯降低炎性細胞因子的含量與增強HA的含量 關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α、MMP-3含量，模型對照組、補腎壯筋湯組與陽性對照組明顯高于正常組(P < 0.01)，補腎壯筋湯組與陽性對照組明顯低于模型組(P 0.05)，補腎壯筋湯組與陽性對照組差異無統(tǒng)計學意義(P > 0.05)，見圖4(1)、圖4(2)、圖(3)。關(guān)節(jié)液中HA含量，模型對照組、補腎壯筋湯組與陽性對照組明顯低于正常組
(P < 0.01)，補腎壯筋湯組與陽性對照組明顯高于模型對照組(P < 0.05)，補腎壯筋湯組與陽性對照組差異無統(tǒng)計學意義(P > 0.05)，見圖4(4)。
(1) 各組關(guān)節(jié)液中IL-1β含量
(2) 各組關(guān)節(jié)液中TNF-α含量
(3) 各組關(guān)節(jié)液中MMP-3含量
圖4 各組關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α、MMP-3及HA含量
注 與正常組比較，1)P < 0.01;與模型對照組比較，2)P < 0.05
4 討 論
OA疼痛病機分為虛實兩類，肝腎虧虛、氣血虛弱，則筋骨失養(yǎng)，即不榮則痛，屬虛證;風寒濕邪侵襲，則經(jīng)絡氣血瘀阻，即不通則痛，屬實證。軟骨下骨屬中醫(yī)學“骨”范疇，關(guān)節(jié)軟骨、韌帶、滑膜、關(guān)節(jié)囊屬中醫(yī)學“筋”范疇。軟骨下骨囊變、軟骨退變屬于痿證，以肝腎虧虛為病理特點;骨贅形成、滑膜炎癥屬于痹證，以脈絡瘀滯為病理特點。OA核心病機為本痿標痹，病在筋骨，病位在肝腎，肝腎虧虛，筋骨失養(yǎng)而為痿，腠理空虛易感風寒濕之邪而為痹[7]。基于OA本痿標痹的病理特點，治以補腎柔肝為主(治痿)，輔以祛風除濕散寒(治痹)。補腎壯筋湯以熟地黃、山萸肉補益肝腎，填精補髓，為君藥;續(xù)斷、杜仲、五加皮助君藥補益肝腎，強筋壯骨，祛風除濕，為臣藥;當歸補血活
血，白芍斂陰和營、柔肝止痛，茯苓健脾和胃、化痰除濕，青皮行氣疏肝，共為佐藥;牛膝補益肝腎，強筋壯骨，活血通經(jīng)，引火(血)下行，使方中諸藥直達病所，為使藥。諸藥合用，共奏補腎柔肝、祛風除濕散寒之功效，長期用于肝腎虧虛型OA的治療，療效顯著[3]。
軟骨退變是OA的主要病理特征，是多因素綜合作用引起的軟骨細胞、軟骨基質(zhì)及軟骨下骨降解與合成偶聯(lián)失衡的結(jié)果。膠原和蛋白多糖是軟骨細胞外基質(zhì)的主要成分，Ⅱ型膠原是軟骨基質(zhì)的特征性膠原成分，構(gòu)成軟骨內(nèi)的纖維網(wǎng)架結(jié)構(gòu);蛋白多糖能吸引大量的水分子形成凝膠，保持軟骨的膨脹能力和良好彈性。OA時，軟骨基質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，以Ⅱ型膠原和蛋白多糖的破壞為主，出現(xiàn)膠原的變性與裂解，蛋白多糖含量下降，引起軟骨細胞功能改變，導致基質(zhì)成分的合成減少，從而加速軟骨退變[8-9]。本研究HE、番紅O-固綠染色結(jié)果顯示，補腎壯筋湯通過抑制軟骨基質(zhì)中蛋白多糖含量的減少和膠原纖維的變性，延緩OA的軟骨退變。
炎癥反應介導的軟骨基質(zhì)降解是引起OA軟骨退變的關(guān)鍵因素，也在OA的病理過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。細胞因子是一組多肽類細胞調(diào)節(jié)物質(zhì)的總稱，包括白細胞介素、腫瘤壞死因子、生長因子、干擾素、細胞刺激因子等。正常情況下，體內(nèi)的細胞因子之間存在相互抑制、相互協(xié)同的一個復雜調(diào)控網(wǎng)絡，維持體內(nèi)免疫應答的規(guī)律進行，保持體內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。在各種刺激因素下，關(guān)節(jié)內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的變化，引起軟骨細胞功能的改變，導致細胞因子表達的失控，產(chǎn)生炎癥反應，從而促進OA的軟骨退變[10-11]。
IL-1β、TNF-α誘導炎癥反應，促進軟骨退變，在OA發(fā)病過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。IL-1β是軟骨退變和炎癥反應的重要介質(zhì)，增強MMP-3表達，抑制軟骨基質(zhì)成分的合成，促進軟骨細胞終末分化，引起軟骨基質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡[12]。TNF-α不僅參與滑膜炎癥反應，還能抑制蛋白聚糖的合成，促進軟骨基質(zhì)降解[13]。IL-1β、TNF-α又稱為“前炎癥因子”，TNF-α既可引起前炎癥反應，又能有效調(diào)節(jié)IL-1β的表達，且可啟動OA細胞因子的級聯(lián)反應，刺激滑膜細胞與軟骨細胞產(chǎn)生MMP-3，加速軟骨基質(zhì)降解[14-15]。HA帶有負電荷，填充在軟骨細胞與膠原纖維之間，具有保護軟骨細胞，穩(wěn)定膠原網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而維持軟骨的力學特性。在OA病理過程中，HA含量明顯減少，促進了OA的軟骨退變[16]。本研究結(jié)果表明，補腎壯筋湯能有效降低關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α、MMP-3的含量，增強關(guān)節(jié)液中HA的含量，從而抑制炎癥反應，延緩OA的軟骨退變。
綜上所述，補腎壯筋湯通過降低炎性細胞因子表達，增強HA含量，抑制軟骨基質(zhì)中蛋白多糖含量的減少和膠原纖維的變性，從而延緩OA的軟骨退變。本研究初步揭示補腎壯筋湯抑制OA軟骨退變的可能作用機制之一，其具體的分子調(diào)控機制，有待于更深入的實驗研究。
5 參考文獻
[1] Kroman SL，Roos EM，Bennell KL，et al.Measurement properties of performance-based outcome measures to assess physical function in young and middle-aged people known to be at high risk of hip and/or knee osteoarthritis：a systematic review[J].Osteoarthritis Cartilage，2014，22(1)：26-39.
[2] Corbett MS，Rice SJ，Madurasinghe V，et al.Acupuncture and other physical treatments for the relief of pain due to osteoarthritis of the knee： network meta-analysis[J].Osteoarthritis Cartilage，2013，21(9)：1290-1298.
[3] 李西海，劉獻祥.補腎壯筋湯干預肝腎虧虛型膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨退變的機制探討[J].福建中醫(yī)藥，2011，42(5)：58-60.
