發(fā)布時(shí)間：2014-06-14所屬分類：醫(yī)學(xué)論文瀏覽：1次
摘 要： 論文摘要：臨床研究顯示，蠲痹顆粒能明顯改善RA活動(dòng)期的臨床癥狀，降低C-反應(yīng)蛋白、紅細(xì)胞沉降率、類風(fēng)濕因子等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，有效率占82.5%。前期實(shí)驗(yàn)研究表明，蠲痹顆粒不僅具有明顯的抗炎、免疫抑制作用，而且對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎及小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎具有
論文摘要：臨床研究顯示，蠲痹顆粒能明顯改善RA活動(dòng)期的臨床癥狀，降低C-反應(yīng)蛋白、紅細(xì)胞沉降率、類風(fēng)濕因子等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，有效率占82.5%。前期實(shí)驗(yàn)研究表明，蠲痹顆粒不僅具有明顯的抗炎、免疫抑制作用，而且對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎及小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎具有顯著的治療作用。
引言
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫性疾病。我國(guó)大陸地區(qū)的RA患病率為0.20%～0.40%[1]。在RA自然病程中，5～10年的致殘率為60%，30年的致殘率為90%，壽命縮短10～15年，而伴關(guān)節(jié)外表現(xiàn)者的5年生存率僅為50%[2]，極大地影響了患病人群的生活質(zhì)量，開展干預(yù)RA研究對(duì)于人類健康具有戰(zhàn)略性意義�；ぱ妆徽J(rèn)為是RA發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制，因此深入研究其發(fā)病機(jī)制及可能的干預(yù)手段成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)界治療RA的熱點(diǎn)問(wèn)題。本研究旨在以溫陽(yáng)散寒除濕法組方的蠲痹顆粒為研究載體，探討中醫(yī)藥干預(yù)RA關(guān)節(jié)病變進(jìn)程的機(jī)制，為中醫(yī)藥干預(yù)炎癥指標(biāo)表達(dá)的機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠50只，雄性，8周
齡，體質(zhì)量(180±20)g，購(gòu)自簡(jiǎn)陽(yáng)達(dá)碩動(dòng)物科技有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(川)：2008-24。飼養(yǎng)于云南省中醫(yī)醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由攝水?dāng)z食。動(dòng)物房溫度維持在20 ℃，濕度維持在70%。
1.2 藥品與試劑 牛Ⅱ型膠原(CⅡ)，購(gòu)自sigma公司。完全弗氏佐劑(CFA)，購(gòu)自美國(guó)BD公司。蠲痹顆粒(JB，主要由附片、川芎、赤芍、桂枝、麻黃、薏苡仁、五加皮等10余味中藥組成)由本院藥劑科提供。甲氨蝶呤片，上海信誼藥廠有限公司生產(chǎn)(批號(hào)H31020644)。大鼠白細(xì)胞介素(IL)-1β Elisa試劑盒，購(gòu)自欣博盛生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)操作步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書執(zhí)行。
2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 動(dòng)物分組 按隨機(jī)數(shù)字表法將動(dòng)物隨機(jī)分為蠲痹低劑量組、中劑量組、高劑量組，甲氨蝶呤組，模型對(duì)照組及空白對(duì)照組(前4組每組10只，后2組每組5只)。
2.2 動(dòng)物造模 除空白對(duì)照組外，其余大鼠均造模。實(shí)驗(yàn)前1天將牛Ⅱ型膠原溶于0.1 mol·L-1醋酸中，配制成總濃度為2 mg·mL-1的溶液，置于4 ℃冰箱過(guò)夜。冰浴下按照1∶1比例與CFA充分混勻，乳化，制成乳劑。以0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%苯巴比妥麻醉大鼠，待麻醉后于距鼠尾根部2～3 cm
處注射，每只200 μL。
2.3 給藥方法 致炎第21天起每日給藥干預(yù)，蠲痹高、中、低劑量組分別以12.0 g·kg-1·d-1、
4.0 g·kg-1·d-1和2.0 g·kg-1·d-1蠲痹顆粒水溶液灌胃，甲氨蝶呤組每周1次給予甲氨蝶呤水溶液10 mg·kg-1
灌胃，模型對(duì)照組與空白對(duì)照組均給予生理鹽水灌胃
10 mL·kg-1·d-1。實(shí)驗(yàn)期間均予SPF級(jí)普通飼料。分別于給藥14 d和28 d(即實(shí)驗(yàn)第35天和第49天)各處死一半動(dòng)物，活殺取血和滑膜組織備測(cè)。
2.4 關(guān)節(jié)炎癥狀評(píng)分 第1天初次免疫前開始，每隔7天采用關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)評(píng)分法及足趾容積測(cè)量法評(píng)價(jià)關(guān)節(jié)炎病變的發(fā)生及嚴(yán)重程度。關(guān)節(jié)炎指數(shù)分為5級(jí)(0～4分)：0分，正常;1分，踝關(guān)節(jié)或腕關(guān)節(jié)輕度發(fā)紅、腫脹，或明顯的發(fā)紅腫脹局限于足趾，不論受累數(shù)目;2分，踝關(guān)節(jié)或腕關(guān)節(jié)中度發(fā)紅、腫脹;3分，踝關(guān)節(jié)或腕關(guān)節(jié)重度發(fā)紅、腫脹;4分，多關(guān)節(jié)最大程度的炎癥腫脹。最高可計(jì)4分。于AI評(píng)估同時(shí)，用足趾容積測(cè)量?jī)x測(cè)量足爪炎癥及腫脹程度。
2.5 取血方法及血清的制備 各組最后1次灌胃后開始禁食，第2天取血，采用腹主動(dòng)脈采血法取血并處死動(dòng)物;血液靜置2 h后，置于3 000 r·min-1離心機(jī)，離心10 min，取上清，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
2.6 大鼠滑膜組織的收集 大鼠處死后，仰位固定，迅速離斷四肢，剝離皮膚，用冷生理鹽水沖洗干凈后置于冰上操作;沿踝關(guān)節(jié)后方打開關(guān)節(jié)囊，可見有一層平滑光亮呈淺淡黃色的滑膜組織;用眼科直鑷鈍性分離關(guān)節(jié)囊的滑膜層和纖維層，完整剝離滑膜組織;最后以眼科鑷輕輕夾住其中央，用眼科剪完整剪下滑膜組織，常規(guī)脫鈣包埋，切片備用。
2.7 滑膜炎癥評(píng)分 ①炎細(xì)胞浸潤(rùn)：0分，無(wú)炎細(xì)胞;1分，稀疏散在;2分，較密集;3分，大量。②纖維組織增生：0分，無(wú)纖維組織增生;1分，少量增生;2分，中量增生;3分，大量增生。③滑
膜細(xì)胞增生：0分，無(wú)滑膜細(xì)胞增生;1分，單層細(xì)胞腫脹密集;2分，兩層細(xì)胞腫脹密集;3分，三層細(xì)胞腫脹密集。④巨噬樣A型細(xì)胞增生：0分，無(wú)巨噬樣A型細(xì)胞;1分，稀疏散在;2分，較密集;3分，大量。
2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，正態(tài)分布資料組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析(ANOVA);偏態(tài)分布資料組間數(shù)據(jù)比較采用秩和檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3 結(jié) 果
3.1 一般情況觀察 實(shí)驗(yàn)期間，因炎癥反應(yīng)較重，共有4只大鼠死亡(低劑量組1只，高劑量組1只，甲氨蝶呤組2只)�？瞻讓�(duì)照組大鼠精神佳，毛色光澤，飲食正常。模型對(duì)照組大鼠易激惹，皮毛粗糙無(wú)光澤，瘦弱少食，體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，部分大鼠行動(dòng)困難。蠲痹低劑量組大鼠皮毛粗糙發(fā)黃，瘦弱懶動(dòng)，蠲痹中、高劑量組和甲氨蝶呤組大鼠皮毛較光澤、精神可、飲食較好。
3.2 各組CIA大鼠35 d、49 d AI評(píng)分比較 35 d
時(shí)，蠲痹低劑量組、甲氨蝶呤組CIA大鼠AI評(píng)分比空白對(duì)照組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
(P < 0.05);其他組AI評(píng)分有增加趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。49 d時(shí)，甲氨蝶呤組CIA大鼠AI評(píng)分比空白對(duì)照組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05);且蠲痹高劑量組在改善AI評(píng)分上明顯優(yōu)于甲氨蝶呤組(P < 0.05)。見表1。
表1 各組CIA大鼠35 d、49 d AI評(píng)分比較 分，
組別 35 d 49 d
蠲痹低劑量組 1.50±1.351) 1.00±1.41
蠲痹中劑量組 0.60±1.08 1.00±1.41
蠲痹高劑量組 0.50±1.23 0.50±1.002)
甲氨蝶呤組 1.60±1.271) 2.60±1.501)
模型對(duì)照組 1.20±1.64 1.50±2.12
空白對(duì)照組 0 02)
注 與空白對(duì)照組同期比較，1)P < 0.05;與甲氨蝶呤組同期比較，2)P < 0.05
3.3 各組CIA大鼠不同時(shí)間點(diǎn)足容積比較 35 d時(shí)，
蠲痹低劑量組CIA大鼠
趾容積比空白對(duì)照組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)，其他組足趾容積有增加趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;49 d時(shí)，各給藥組與模型對(duì)照組比較，足趾容積有減小趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。見表2。
表2 各組CIA大鼠不同時(shí)間點(diǎn)足容積比較 mL，
組別 0 d 35 d 49 d
蠲痹低劑量組 1.61±0.11 2.70±0.761) 2.42±0.67
蠲痹中劑量組 1.61±0.06 2.13±0.65 2.49±0.46
蠲痹高劑量組 1.58±0.08 2.08±0.73 1.91±0.45
甲氨蝶呤組 1.57±0.09 2.47±0.59 2.52±0.43
模型對(duì)照組 1.66±0.06 2.55±0.96 2.58±1.11
空白對(duì)照組 1.62±0.12 1.74±0.17 1.96±0.09
注 與空白對(duì)照組同期比較，1)P < 0.05
3.4 各組CIA大鼠35 d、49 d IL-1β比較 35 d時(shí)，
血清IL-1β水平，各組與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01);蠲痹高劑量組在改善血清IL-1β水平上優(yōu)于甲氨蝶呤組(P < 0.05)。49 d時(shí)，各組與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01)，蠲痹中、高劑量組在改善血清IL-1β水平上明顯優(yōu)于甲氨蝶呤組(P < 0.01)。見圖1、表3。
圖1 大鼠血清IL-1β Elisa檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線
表3 各組CIA大鼠35 d、49 d IL-1β比較 Pg·mL-1，
組別 35 d 49 d
蠲痹低劑量組 131.50±34.171) 647.03±171.761)
蠲痹中劑量組 227.26±39.311) 284.74±30.111)3)
蠲痹高劑量組 42.19±41.641)2) 1 34.68±43.791)3)
甲氨蝶呤組 156.48±72.701) 668.19±104.991)
模型對(duì)照組 575.93±10.34 1 433.16±95.15
空白對(duì)照組 33.18±6.151)2) 23.08±1.381)3)
注 與模型對(duì)照組同期比較，1)P < 0.01;與甲氨蝶呤組同期比較，2)P < 0.05，3)P < 0.01
3.5 溫陽(yáng)散寒除濕法對(duì)CIA大鼠滑膜組織炎癥的影響
3.5.1 CIA大鼠滑膜組織病理觀察 見圖2。
模型對(duì)照組(49 d) 空白對(duì)照組(49 d)
圖2 大鼠滑膜組織病理光鏡切片(HE染色×200)
3.5.2 各組CIA大鼠35 d、49 d滑膜組織炎癥評(píng)分比較 CIA大鼠滑膜組織炎癥評(píng)分，35 d時(shí)，各組與模型對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05);49 d時(shí)，蠲痹中劑量組在改善滑膜組織炎癥評(píng)分上優(yōu)于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)，蠲痹高劑量組明顯優(yōu)于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01)。見表4。 (下轉(zhuǎn)第42頁(yè))
(上接第19頁(yè))
表4 各組CIA大鼠35 d、49 d滑膜組織炎癥評(píng)分比較 分，
組別 35 d 49 d
蠲痹低劑量組 2.40±3.36 4.20±3.35
蠲痹中劑量組 5.00±2.92 3.60±2.071)
蠲痹高劑量組 1.60±1.95 2.40±1.672)
甲氨蝶呤組 3.60±2.41 4.80±2.78
模型對(duì)照組 5.00±2.00 8.00±0.00
空白對(duì)照組 0.50±0.71 0.33±0.582)3)
注 與模型對(duì)照組同期比較，1)P < 0.05;2)P < 0.01;與甲氨蝶呤組同期比較，3)P < 0.05
4 討 論
蠲痹顆粒是著名中醫(yī)學(xué)家吳佩衡學(xué)術(shù)繼承人、云南省名老中醫(yī)吳生元教授基于扶陽(yáng)理論，總結(jié)出治療RA的有效良方，具有溫經(jīng)散寒、祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛之功，主治寒濕痹阻之RA。近6年來(lái)，蠲痹顆粒使用范圍擴(kuò)大到云南中醫(yī)醫(yī)療集團(tuán)54家醫(yī)院近1 000例RA患者，顯示了良好的臨床療效，且無(wú)明顯毒副作用，倍受廣大RA患者歡迎。
臨床研究顯示，蠲痹顆粒能明顯改善RA活動(dòng)期的臨床癥狀，降低C-反應(yīng)蛋白、紅細(xì)胞沉降率、類風(fēng)濕因子等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，有效率占82.5%[3]。前期實(shí)驗(yàn)研究表明，蠲痹顆粒不僅具有明顯的抗炎、免疫抑制作用，而且對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎及小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎具有顯著的治療作用[4-6]。本次研究亦提示，蠲痹顆粒能對(duì)抗膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥病變進(jìn)展，減輕滑膜炎癥，其治療作用可能與抑制相關(guān)炎癥因子分泌、釋放有關(guān)，相關(guān)作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。
5 參考文獻(xiàn)
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