發布時間：2020-02-22所屬分類：醫學論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要背景：研究表明Asxl1的缺失可導致骨質發育不全、骨質缺損類疾病的發生，但目前在根尖周炎環境下該因子與骨破壞之間的關系暫無相關報道。目的：探討炎性微環境下Asxl1對成骨細胞增殖分化的影響。方法：實驗選用脂多糖刺激MC3T3-E1細胞建立體外炎性微環境
摘要背景：研究表明Asxl1的缺失可導致骨質發育不全、骨質缺損類疾病的發生，但目前在根尖周炎環境下該因子與骨破壞之間的關系暫無相關報道。目的：探討炎性微環境下Asxl1對成骨細胞增殖分化的影響。方法：實驗選用脂多糖刺激MC3T3-E1細胞建立體外炎性微環境，通過CCK-8實驗篩取脂多糖最佳質量濃度和最佳作用時間，然后用20mg/L脂多糖刺激MC3T3-E1細胞24h，免疫熒光檢測Asxl1的蛋白表達水平，RealTime-PCR檢測Asxl1mRNA的表達水平。為進一步驗證Asxl1基因在炎性微環境中影響成骨細胞的增殖與分化，脂多糖刺激形成炎性微環境后轉染Asxl1-SiRNA24h，采用CCK-8檢測細胞增殖活性，RealTime-PCR檢測Asxl1及成骨相關基因ALP和RUNX2mRNA的表達水平。結果與結論：①脂多糖刺激MC3T3-E1細胞后，Asxl1蛋白和mRNA表達水平呈降低趨勢;②脂多糖刺激MC3T3-E1細胞后，轉染Asxl1-SiRNA24h，細胞增殖活性下降趨勢明顯，Asxl1基因及成骨相關基因ALP和RUNX2mRNA的表達水平明顯降低;③結果提示，Asxl1可能通過參與炎性反應過程，影響成骨細胞的增殖與分化，進而參與骨破壞進程。
關鍵詞：MC3T3-E1細胞;Asxl1;根尖周炎;骨破壞;基因轉染;脂多糖;成骨分化;國家自然科學基金
0引言Introduction
根尖周炎是發生于牙根尖周軟硬組織的破壞性疾病，多繼發于牙髓病及根尖周圍組織其他炎性疾病。當根尖周炎癥處于慢性進展期時，其炎癥反應過程受機體全身狀態的影響。牙髓病長期不治療或經根管治療不徹底，根管內存在大量感染性物質或病原微生物，導致根管內炎癥遞質、細胞因子和相關酶釋放，激活大量炎癥細胞，從而引發根尖周炎[1-3]，其主要臨床表現為肉芽組織的形成和牙槽骨骨質的破壞[4-6]。骨質破壞即骨形成的動態偶聯過程遭到破壞，此時成骨細胞形成新骨的能力弱于破骨細胞吸收舊骨的能力，骨穩態平衡被打破[7]。已知炎癥微環境可通過抑制成骨細胞的增殖與分化，從而破壞正常的骨偶聯過程，導致骨質破壞[8]。慢性根尖周炎造成的骨破壞，即當根尖周圍組織處于炎性微環境時，宿主通過對炎癥微生物及其感染物質作出的免疫反應。針對炎癥反應造成的骨穩態失衡機制較復雜，仍然有待進一步研究。
脂多糖是大多數革蘭陰性細菌細胞壁的主要脂質成分，其包含3個結構：脂質A、核心寡糖和可變多糖(O抗原)[9-10]。脂多糖可在細菌細胞分裂或死亡過程中釋放，形成細胞內毒素，導致單核細胞和吞噬細胞產生大量細胞因子，引起炎癥發生[11]。因而，脂多糖常被廣泛用于誘導炎癥環境發生的分子機制研究[12]。
Asxl1被發現存在于染色體上，編碼核蛋白，對基因表達穩定性的維持起主要作用。該基因表達于所有的造血細胞，且在其他多種組織中也存在廣泛表達[13-14]。Asxl1基因突變體最早發現于骨髓樣惡性腫瘤患者中，如急性髓系白血病、骨髓增生異常綜合征等疾病，因此，眾多學者主要研究方向為該基因與髓系疾病之間的關系，結果發現Asxl1基因突變體存在于多種髓系腫瘤患者的造血細胞中，往往預后不良[15-17]。但近期有研究學者發現該基因可影響骨髓間充質干細胞成骨分化，同時研究發現Asxl1基因缺失會誘導骨髓間充質干細胞遠離成骨分化[18]，導致骨偶聯失衡即破壞骨穩態，因此Asxl1基因與骨破壞之間也存在一定的關系。為了近一步研究Asxl1與骨破壞之間的關系，以及該基因在根尖周炎環境下與骨破壞的關系，該實驗選取小鼠胚胎成骨前體細胞MC3T3-E1作為研究對象，用脂多糖刺激細胞模擬體外炎性微環境，探討Asxl1基因在炎癥環境下對成骨前體細胞的作用，從而為根尖周病骨破壞的防治提供可能的靶向基因。
1材料和方法Materialsandmethods
1.1設計體外實驗研究觀察。
1.2時間及地點2017至2019年在大連醫科大學口腔醫學院細胞實驗室完成。
1.3材料
1.3.1實驗細胞小鼠胚胎成骨前體細胞(MC3T3-E1)購于上海素爾生物科技有限公司。
1.3.2實驗儀器和試劑低溫離心機、二氧化碳培養箱(Thermo);超凈工作臺(Boxun);顯微照相系統(OLYMPUS);酶標儀、反轉錄儀(BIO-RAD);PCR儀(TaKaRa);α-MEM培養基(Hyclone);胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco);CCK-8(東仁化學科技有限公司);總RNA提取試劑盒(生物工程股份有限公司);反轉錄試劑盒(TaKaRa);TBGreenTMPremixExTaqTMⅡ(TaKaRa);Asxl1-SiRNA、NegativeControl(NC)(蘇州吉瑪基因);XfectTMRNATransfectionReagent(TaKaRa)。
1.4實驗方法
1.4.1細胞培養以5×105每孔的密度將小鼠胚胎成骨前體細胞MC3T3-E1細胞接種于T25透氣培養瓶中，用體積分數為10%胎牛血清、1%雙抗的α-MEM培養液對細胞進行培養，置于37℃、體積分數為5%CO2孵箱中孵育，隔天換液，待細胞長滿至80%左右，胰酶消化，進行傳代，取狀態好的細胞用于后續實驗。
1.4.2CCK-8檢測細胞增殖情況將MC3T3-E1細胞以每孔2000個的密度接種于96孔板中，分別加入0，1，10，20，50mg/L脂多糖刺激MC3T3-E1細胞24h，以篩取最佳作用質量濃度，加入0，20mg/L脂多糖分別刺激0，24，48h，以篩取最佳作用時間。按1∶9(CCK-8溶液∶α-MEM培養基)的比例配置混合溶液，每孔總量100μL(加液時應將液體緊貼孔壁緩慢注入，此過程是為了避免加液過程中氣泡的產生，從而防止對實驗結果造成誤差)，37℃、體積分數為5%CO2培養箱內孵育1h，測定吸光度值。
1.4.3免疫熒光檢測Asxl1蛋白表達將第3代MC3T3-E1細胞以2×106的密度接種于培養皿，待細胞貼壁并長至細胞與細胞接觸且無重疊時進行實驗，用0，20mg/L脂多糖刺激MC3T3-E1細胞24h，棄原培養液，PBS清洗3遍，每次5min，40g/L多聚甲醛固定約20min，PBS清洗，0.25%Triton破膜20min，PBS清洗，封閉液封閉20min，一抗(Asxl1PolyclonalAntiboby)4℃過夜，PBS清洗，二抗(山羊抗兔IgG/TRITC)常溫避光孵育1h，PBS清洗，DAPI染色8min，PBS清洗去除多余染料，防淬滅封固劑封固，熒光顯微鏡觀察。
1.4.4RealTime-PCR檢測Asxl1mRNA表達將第3代MC3T3-E1細胞以1×106的密度接種于6孔板，待細胞長至80%左右，用0，20mg/L脂多糖刺激MC3T3-E1細胞24h，根據RNA提取試劑盒說明書提取RNA，操作時應注意無菌，以免RNA降解或污染，以該RNA為模板，反轉錄為cDNA用于后續實驗。實驗所有引物均由寶生物工程有限公司(TaKaRa公司)代為合成，以GAPDH作為內參引物，序列見表1。
1.4.5基因轉染①實驗組：Asxl1-SiRNA和轉染試劑的混合液(5μLAsxl1-SiRNA+95μLXfect+100μL轉染試劑);②陰性對照組：空載對照和轉染試劑的混合液(5μL空載對照+95μLXfect+100μL轉染試劑);③空白對照組：僅含有轉染試劑(100μL轉染試劑)。將第3代MC3T3-E1細胞以每孔1×105的密度接種于6孔板中，先用20mg/L脂多糖刺激MC3T3-E1細胞24h，棄原培養液，每孔加1mLα-MEM培養基饑餓培養，配置轉染試劑，靜置15min后，加入相應孔內;6-8h后換正常培養液，24h后提取樣本。按上述CCK-8法檢測在脂多糖炎性微環境中沉默Asxl1基因后MC3T3-E1細胞增殖活性，RealTime-PCR檢測Asxl1及成骨相關因子ALP和RUNX2mRNA表達水平變化。
1.5主要觀察指標①MC3T3-E1細胞處于脂多糖介導的炎性微環境中，Asxl1基因和蛋白的表達水平;②MC3T3-E1細胞在炎性微環境中沉默Asxl1基因后，細胞增殖活性和成骨相關因子ALP、RUNX2基因表達水平。
1.6統計學分析通過SPSS17.0軟件，運用one-wayANOVA分析各組實驗結果。結果數據按x_±s的形式表示，P<0.05為差異有顯著性意義。
2結果Results
2.1CCK-8篩取脂多糖最佳實驗質量濃度及實驗時間
2.1.1篩取最佳實驗質量濃度分別加入0，1，10，20，50mg/L脂多糖刺激MC3T3-E1細胞24h，各實驗組分別與0mg/L脂多糖組比較，差異有顯著性意義(P<0.05)，當質量濃度為1mg/L時細胞增殖活性少量增加，說明低質量濃度脂多糖刺激可能對成骨細胞增殖起促進作用，而當質量濃度為50mg/L時細胞增殖活性降低最明顯，但此時對細胞殺傷力較大，為確保后續實驗順利進行，最終確定以20mg/L為最佳實驗質量濃度，見圖1A。
2.1.2篩取最佳作用時間以0，20mg/L脂多糖分別刺激0，24，48h，結果顯示實驗組細胞的增殖活性呈降低趨勢，差異有顯著性意義(P<0.05)，且在24h抑制明顯，因此確定最佳實驗時間24h，見圖1B。
2.2免疫熒光檢測Asxl1的表達水平免疫熒光結果顯示Asxl1在MC3T3-E1中有表達;加入脂多糖刺激后，其表達量明顯降低，見圖2，提示Asxl1基因可能參與炎癥反應過程。
2.3脂多糖作用于成骨細胞后Asxl1mRNA的表達水平與對照組相比，用20mg/L脂多糖刺激MC3T3-E1細胞24h后，Asxl1mRNA表達量明顯降低，差異有顯著性意義(P<0.05)，見圖3。
2.4在脂多糖炎性微環境中沉默Asxl1基因后MC3T3-E1細胞增殖活性以及成骨相關因子ALP、RUNX2基因表達水平變化轉染Asxl1-SiRNA24h后，實驗組分別與陰性對照組、空白對照組相比，MC3T3-E1細胞的增殖活性均明顯降低，差異有顯著性意義(P<0.05)，見圖4A。轉染Asxl1-SiRNA24h后，實驗組分別與陰性對照組、空白對照組相比，Asxl1及成骨細胞相關基因ALP和RUNX2mRNA表達量明顯降低，差異有顯著性意義(P<0.05)，見圖4B。
3討論Discussion
維持骨穩定狀態的機制較為復雜，目前已知其不僅與破骨細胞形成、骨吸收增加相關，也與成骨細胞數目減少、分化受到抑制有密不可分的關系。研究發現成骨細胞不僅僅局限于通過促進細胞外骨基質的合成、分泌與礦化而實現新骨的形成[19];它還可積極地調節破骨細胞與造血干細胞在體內的形成與功能，維持機體平衡，同時成骨細胞也是一種內分泌細胞，影響體內能量代謝[20];可參與多條信號通路，例如Wnt/β-Catenin通路和Notch信號通路;ALP和RUNX2是成骨細胞的主要標志性因子，前者可作為成骨早期分化的指標，后者是成骨細胞分化的特異性轉錄因子[21-23]。由研究可知，骨髓間充質干細胞可向成骨分化，從而形成成骨細胞[24]。骨髓間充質干細胞是具備自我更新及多譜系分化潛能的多潛能干細胞，包括成骨、軟骨、脂肪等的形成[25-27]，其中骨髓間充質干細胞成骨分化和成脂分化之間的關系對于正常的骨穩態至關重要[28-29]。
近期有研究顯示Asxl1無效等位基因的缺失可導致多種骨骼發育缺陷，包括發育不全、骨礦化密度顯著降低、眶上脊發育不全等。這種有缺陷的骨骼發育與骨髓間充質干細胞的自我更新受損及譜系調控偏離相關，遠離成骨細胞分化而傾向成脂細胞分化[30-31]。Asxl1基因的缺失影響骨髓間充質干細胞的發展命運，而促進骨髓惡性腫瘤的發展[32]。Asxl1基因突變可導致Bohring-Opitz綜合征，是一種具有發育遲緩、小頭畸形等特點且死亡率極高的罕見遺傳病[33-34]。Asxl1對于維持骨髓間充質干細胞正常分化功能及在骨骼發育過程中發揮重要作用，同時Asxl1可能參與骨破壞過程。當骨質處于炎性環境時，也會形成骨破壞。據文獻研究報道，炎癥環境可通過產生炎癥因子，從而抑制成骨細胞的增殖與分化，使得骨平衡遭到破壞，骨質缺失，最終形成骨破壞[35-36]。如炎癥因子腫瘤壞死因子α可以降低骨細胞中膠原的產生、骨鈣素的合成，從而干擾成骨細胞分化及代謝活性而抑制骨的形成，還能通過抑制Wnt通路，阻斷成骨細胞接受機體發出的形成新骨的信號[37-39];白細胞介素1可通過誘導基質酶的產生以及激活NLRP3炎性體，從而對骨組織產生損傷，破壞骨穩態[40-41]。炎癥導致的骨破壞機制較為復雜，仍有待進一步研究。實驗將探討Asxl1基因在炎癥微環境下對成骨細胞增殖與分化的作用，從而探討Asxl1基因與骨破壞之間的關系，為根尖周炎骨破壞的研究提供一條新的思路。
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實驗選用脂多糖刺激MC3T3-E1細胞建立體外炎性微環境。首先篩取脂多糖最佳質量濃度，設計0，1，10，20，50mg/L濃度梯度進行實驗，模擬炎性微環境，在其余條件均相同的情況下刺激細胞24h，CCK-8結果顯示脂多糖質量濃度為1mg/L時，細胞的增殖活性與對照組相比升高，隨著質量濃度的增加，細胞增殖活性逐漸降低，50mg/L脂多糖時降低最明顯，但此時炎性環境對細胞殺傷力較大，為保證后續實驗順利進行，選擇20mg/L為最佳質量濃度，該結果提示低質量濃度脂多糖可能對成骨細胞起促進作用，而隨著脂多糖質量濃度的持續增加細胞增殖受到抑制，且表現出濃度依賴性;其次篩出脂多糖最佳作用時間，將實驗分為2組：MC3T3-E1組(僅含細胞，無脂多糖刺激)和MC3T3-E1+脂多糖組(脂多糖質量濃度為20mg/L)，在相同條件下，分別對兩組MC3T3-E1細胞刺激0，24，48h，CCK-8結果顯示MC3T3-E1+脂多糖組較對照組的細胞增殖活性降低，且與刺激48h相比較，刺激24h時MC3T3-E1細胞的增殖活性降低較明顯，推測隨著時間的增長可能有其他信號通路參與其中，調控MC3T3-E1細胞增殖。通過檢測脂多糖刺激組與正常對照組細胞中Asxl1mRNA的表達，驗證Asxl1基因是否受到炎性微環境的影響，結果發現脂多糖刺激組Asxl1基因表達量較正常對照組明顯降低，且免疫熒光結果也顯示炎性微環境下Asxl1的表達量與正常對照組比較有所減少，說明Asxl1可能參與炎癥反應過程。
為進一步驗證Asxl1基因在炎性微環境中影響成骨細胞的增殖與分化，實驗通過模擬體外炎癥微環境，同時在MC3T3-E1細胞中沉默Asxl1基因，結果發現與陰性對照組和空白對照組相比，沉默Asxl1基因后成骨相關基因ALP和RUNX2mRNA的表達量呈降低趨勢，細胞增殖活性也降低明顯。結果表明，通過抑制Asxl1基因能影響骨形成過程，破壞骨穩態。該結果與ZHANG等[18]學者研究結果一致，他們通過在體內建立Asxl1基因敲除模型，發現在不同條件下體內模型均表現出不同程度的骨質缺失及骨質發育不全。
實驗主要的不足之處：一是未研究Asxl1基因與破骨細胞之間的關系，因為骨穩態不僅與成骨細胞有關，與破骨細胞也有密切聯系，只有新骨不斷的形成與舊骨不斷的破壞處于動態平衡時，骨質才能正常代謝;二是實驗未建立小鼠體內根尖周炎模型，沒有對Asxl1基因是否通過參與炎癥反應過程影響成骨細胞增殖分化加以驗證;三是實驗未進行蛋白層面的研究。探討Asxl1基因與根尖周炎骨破壞之間的關系，可為臨床根治根尖周炎提供靶向基因，但Asxl1基因與根尖周炎骨破壞之間仍有較多問題存在，這將是實驗室繼續研究的重點與方向。
綜上所述，Asxl1基因參與骨質形成過程，在炎癥微環境下，Asxl1基因的減少可進一步抑制成骨細胞的增殖與分化從而破壞骨穩態，引起骨破壞，導致根尖周炎。但Asxl1基因與根尖周炎骨破壞之間尚存疑點，有待進一步研究，從而為根尖周病的防治提供可能的靶向基因。
SCISSCIAHCI
