關節軟骨細胞和骨髓間充質干細胞不同共培養方式對細胞增殖與分化的影響

發布時間：2019-10-29所屬分類：醫學論文瀏覽：1次

摘 要： 摘要 背景：在關節軟骨細胞和骨髓間充質干細胞共培養環境中，軟骨細胞功能活躍，增殖速度加快，骨髓間充質干細胞促進了軟骨細胞的表型維持，而且少量軟骨細胞提供的微環境能夠誘導骨髓間充質干細胞成軟骨分化，降低了軟骨分化過程中出現的肥大表型和軟骨內骨

　　摘要

　　背景：在關節軟骨細胞和骨髓間充質干細胞共培養環境中，軟骨細胞功能活躍，增殖速度加快，骨髓間充質干細胞促進了軟骨細胞的表型維持，而且少量軟骨細胞提供的微環境能夠誘導骨髓間充質干細胞成軟骨分化，降低了軟骨分化過程中出現的肥大表型和軟骨內骨化，但是影響共培養系統中細胞增殖分化的因素和細胞間相互作用的機制尚不明確。目的：觀察軟骨細胞和骨髓間充質干細胞接觸共培養對細胞增殖分化的影響，進一步優化共培養方式，為探討共培養系統中二者的相互作用機制提供依據。方法：分離和培養新西蘭兔(南京醫科大學實驗動物中心提供)軟骨細胞和骨髓間充質干細胞，取第 2 代軟骨細胞和骨髓間充質干細胞，以 1∶3 的比例直接混合在 24 孔板進行接觸共培養為接觸共培養組，以 1∶3 比例分別在 Transwell 的上室和下室進行非接觸共培養為非接觸共培養組，共培養 21 d。細胞爬片進行甲苯胺藍染色、COL2a1 及 Cx43 細胞免疫化學染色。應用 CCK8 檢測共培養系統中細胞的增殖情況，ELISA 檢測共培養細胞上清液中糖胺聚糖和轉化生長因子 β3 水平，Western blot 檢測共培養細胞 COL2a1 和 Cx43 的表達。然后添加轉化生長因子 β3 進行軟骨細胞和骨髓間充質干細胞接觸共培養和非接觸共培養，比較細胞增殖、糖胺聚糖水平、COL2a1 及 Cx43 蛋白表達的變化。結果與結論：①隨著共培養時間的延長，細胞增殖能力逐漸增高，接觸共培養組細胞吸光度值明顯高于非接觸共培養組(P < 0.05)，糖胺聚糖和轉化生長因子 β3 水平以及 COL2a1 和 Cx43 的蛋白表達明顯高于非接觸共培養組;②添加 10 µg/L 轉化生長因子 β3 共培養 21 d，接觸共培養組細胞增殖、糖胺聚糖水平、COL2a1 及 Cx43 的表達與未添加轉化生長因子 β3 比較無明顯變化(P > 0.05)，而非接觸共培養組的細胞增殖、糖胺聚糖水平、COL2a1 及 Cx43 蛋白表達明顯提高(P < 0.05)，但仍明顯低于未添加轉化生長因子 β3 的接觸共培養組(P < 0.05);③結果表明，接觸共培養比非接觸共培養明顯促進細胞的增殖和分化，Cx43 在其中起重要作用。

　　關鍵詞：關節軟骨細胞;骨髓間充質干細胞;共培養;增殖;分化;糖胺聚糖;Ⅱ型膠原;轉化生長因子 β3;縫隙連接;連接蛋白;干細胞

　　0 引言 Introduction

　　由于關節軟骨無血管、神經組織，其自身缺乏有效的修復能力，組織工程技術為解決這一難題提供了新思路，安全可靠的種子細胞源是構建組織工程化軟骨的前提。自體關節軟骨細胞(articular chondrocytes，ACs)作為種子細胞，其在體外培養增殖能力低，連續傳代后發生去分化喪失表達Ⅱ型膠原的能力，從而失去原有的表型，并且獲取軟骨細胞的來源受限，存在供區并發癥;而骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)作為種子細胞則需要多種生長因子的誘導，分化過程中產生典型的肥大表型和骨化標志堿性磷酸酶及Ⅹ型膠原而發生軟骨內骨化[1-3]。因此，ACs和BMSCs均不能完全滿足軟骨組織工程對種子細胞的要求，而將兩種細胞進行共培養就成為可供選擇的方式[1-6]。大量的研究和作者前期實驗發現 ACs和BMSCs接觸共培養能夠促進ACs的增殖和表型維持，而且少量ACs為BMSCs提供了軟骨分化的微環境，因此，ACs和BMSCs共培養為解決ACs來源不足提供了切實可行的途徑[3-6]，但是影響共培養系統中細胞增殖和分化的因素及調節細胞之間作用的機制尚不明確，為此，該研究觀察ACs和BMSCs接觸共培養對細胞增殖和分化的影響，進一步優化共培養方式，為構建工程化軟骨提供新的策略。

　　1 材料和方法 Materials and methods

　　1.1 設計 細胞學及分子生物學隨機對比實驗。

　　1.2 時間及地點 于2017年1至12月在徐州醫科大學附屬連云港市東方醫院臨床研究中心實驗室完成。

　　1.3 材料

　　1.3.1 實驗動物 健康2月齡新西蘭兔12只，雌雄不限，體質量0.8-1.2 kg，由南京醫科大學實驗動物中心提供，動物使用許可證號：201500099。實驗過程中對動物處置符合動物倫理學標準。

　　1.3.2 實驗試劑與儀器 DMEM培養基(Gibco公司，美國);青/鏈霉素(碧云天生物技術研究所，上海);胎牛血清 (Hyclone公司，美國);轉化生長因子β3(Peprotech公司，美國);甲苯胺藍染液(Sigma公司，美國);Transwell培養系統(Corning公司，美國);CCK8試劑盒(碧云天生物技術研究所，上海);Ⅱ型膠原酶(Gibco公司，美國);GAG定量分析酶聯吸附分析試劑盒(武漢優爾生科技股份有限公司 USCN，武漢);轉化生長因子β3免疫試劑盒(武漢優爾生科技股份有限公司USCN，武漢);Ⅱ型膠原(type II collagen， COL2)單克隆抗體(Novus，美國);連接蛋白43(connexin 43，Cx43)單克隆抗體(Abcam公司，美國);GAPDH單克隆抗體(Abcam公司，美國);HRP標記的山羊抗兔二抗(中杉金橋，北京);DAB顯色劑(碧云天生物技術研究所，上海);相差顯微鏡(Olympus顯微鏡，日本);CO2恒溫孵育箱 (Thermo公司，美國);酶標儀(Molecular Devices公司，美國);Tanon-5200化學發光儀(天能公司，上海)。

　　1.4 實驗方法

　　1.4.1 BMSCs和ACs的分離培養和共培養 應用作者所在實驗室提供的方法進行BMSCs和ACs分離培養[3，6]。

　　在局麻下用骨穿針于新西蘭兔脛骨和股骨骨髓腔抽取骨髓并且肝素化，應用密度梯度離心和貼壁培養法分離出 BMSCs，在體積分數5%CO2孵育箱中37 ℃飽和濕度條件下用含體積分數為10%胎牛血清的DMEM培養基進行培養。

　　無菌條件下切取新西蘭兔膝關節軟骨，PBS漂洗后用眼科剪刀剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，應用0.25%胰蛋白酶和0.1%Ⅱ型膠原酶進行消化，200目濾網過濾后離心，用PBS漂洗再次離心后在同一條件下進行ACs培養。

　　實驗取第2代ACs和第2代BMSCs以1∶3的比例進行接觸共培養和非接觸共培養，細胞總數為4×104 。

　　1.4.2 ACs和BMSCs接觸共培養和非接觸共培養 取第2 代ACs和第2代BMSCs，按1∶3的比例在上述同一條件下直接混合進行接觸共培養為接觸共培養組，按1﹕3的比例在Transwell的上室和下室進行非接觸共培養為非接觸共培養組。孔板底部和Transwell的下室均放置蓋玻片進行細胞爬片。每3 d更換1次培養基，共培養21 d。

　　1.4.3 添加轉化生長因子β3進行BMSCs和ACs接觸共培養和非接觸共培養 向接觸共培養組和非接觸共培養組分別加入10 µg/L的轉化生長因子β3進行共培養21 d。

　　1.5 主要觀察指標

　　1.5.1 共培養后細胞形態學變化以及免疫化學染色檢測共培養細胞COL2a1和Cx43的表達 共培養21 d，取出細胞爬片，PBS沖洗后應用預冷的40 g/L多聚甲醛固定 10 min，加入甲苯胺藍進行細胞染色，相差顯微鏡下觀察細胞形態和蛋白多糖的合成。分別應用COL2a1和Cx43的鼠抗兔單克隆抗體進行細胞免疫化學染色評價共培養細胞 COL2a1和Cx43的表達。

　　1.5.2 CCK8試劑盒檢測共培養細胞的增殖情況 取共培養細胞懸液100 μL接種至96孔板，每孔加入10 μL的CCK8 (n=6)，在培養箱中共孵育2 h，根據操作說明，應用酶標儀測定波長為450 nm處的吸光度值，根據吸光度值繪制共培養細胞的生長曲線。

　　1.5.3 ELISA法測定共培養系統中糖胺多糖和轉化生長因子β3水平 收集共培養細胞的上清液，按照酶聯免疫試劑盒操作說明檢測共培養細胞上清液中糖胺多糖和轉化生長因子β3水平。

　　1.5.4 Western blot檢測共培養細胞COL2a1和Cx43的表達 共培養21 d，加入預冷的RIPA裂解液裂解細胞，4 ℃ 下12 000 r/min離心10 min，收集細胞上清液。應用BCA 蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度，加入5×RSB，煮沸5 min， -20 ℃保存。每個泳道加20-40 μg蛋白樣品，10% SDS-PAGE電泳后轉印到PVDF膜上，分別與COL2a1和 Cx43的單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗結合，檢測上述蛋白的表達水平。應用Image J圖像分析系統，根據蛋白條帶灰度分析共培養細胞COL2a1和Cx43表達的差異。

　　1.6 統計學分析 應用SPSS 17.0統計軟件進行數據處理。計量資料用x _ ±s表示，符合正態分布的兩組均數比較采用獨立樣本t 檢驗;多組比較采用單因素方差分析，各組之間兩兩比較采用q 檢驗，P < 0.05為差異有顯著性意義。

　　2 結果 Results

　　2.1 共培養細胞的形態變化 分離培養的第2代BMSCs 呈紡錘形或長梭形，細胞折光性強，與成纖維細胞形態相似，排列具有方向性，呈漩渦樣或輻射狀，見圖1A。第2 代ACs呈多角形、三角形或不規則的卵圓形，核為圓形或橢圓形，可見成簇生長現象，細胞核居細胞中心，胞漿豐富，細胞增殖融合為單層，呈多邊形或星形，排列緊密為 “鋪路石”樣，見圖1B。

　　接觸共培養組共培養4 h細胞開始貼壁，隨著ACs和 BMSCs共培養時間的延長，長梭形細胞逐漸變為多角形、類圓形，呈聚集生長，形態接近軟骨細胞。接觸共培養21 d，甲苯胺藍染色顯示共培養細胞及其周圍基質濃染，細胞核質分界清晰，細胞核被染成深藍色，胞質染成藍紫色，見圖2A。細胞免疫化學COL2a1染色后胞漿染成棕黃色，胞核不著色，為強陽性，見圖2B。

　　非接觸共培養組共培養21 d，觀察Transwell下室的 BMSCs，發現僅有部分細胞變為多角形或類圓形，大部分細胞仍呈長梭形或短梭形，甲苯胺藍染色顯示共培養細胞及其周圍基質染色較淺，COL2a1染色為弱陽性，而ACs 體積和核漿比例變化不大，見圖3。 2.2 ACs和BMSCs接觸共培養對細胞增殖分化的影響隨著ACs和BMSCs共培養時間的延長，共培養細胞平均吸光度值逐漸增高，共培養21 d接觸共培養組細胞吸光度值明顯高于非接觸共培養組(P < 0.05)，見圖4。培養上清液中糖胺多糖和轉化生長因子β3水平，見表1。共培養細胞COL2a1和Cx43的表達明顯高于非接觸共培養組(P < 0.05)，見圖5。

　　2.3 外源性轉化生長因子β3對共培養細胞增殖分化的影響 接觸共培養組和非接觸共培養組添加10 µg/L轉化生長因子β3進行共培養21 d，接觸共培養組添加轉化生長因子β3前后細胞增殖無明顯變化(P > 0.05)，見圖4，培養上清液中糖胺多糖水平和共培養細胞COL2a1及Cx43的表達增高也無顯著性意義(P > 0.05);而非接觸共培養組添加轉化生長因子β3后細胞的增殖、培養上清液糖胺多糖水平和共培養細胞COL2a1及Cx43的表達則明顯提高(P < 0.05)，但仍明顯低于接觸共培養組(P < 0.05)，見表1，圖5和圖6。

　　3 討論 Discussion

　　關節軟骨主要由透明軟骨細胞和細胞外基質(以Ⅱ型膠原和多聚蛋白多糖為主)構成，無血管和神經支配，損傷缺損后難以自我修復[1-6]。組織工程學技術為解決這一難題提供了新方法，安全可靠的種子細胞源是構建組織工程化軟骨的前提。ACs和BMSCs都可能用于構建組織工程化軟骨，但是軟骨細胞獲取受限，并且體外培養增殖能力低，在連續傳代后發生去分化喪失表達Ⅱ型膠原的能力，其表型難于維持，產生的細胞外基質以Ⅰ型膠原為主，其機械強度、彈性模量等力學性能較Ⅱ型膠原明顯降低;而 BMSCs作為種子細胞則需要多種生長因子的誘導，分化過程中產生典型的肥大表型和骨化標志Ⅹ型膠原及堿性磷酸酶而發生軟骨內骨化。因此，ACs和BMSCs均不能完全滿足軟骨組織工程對種子細胞的要求[1-6]。大量研究表明 BMSCs和ACs共培養能夠促進ACs的增殖和表型維持，而且少量ACs為BMSCs的軟骨分化提供了微環境，減少了 ACs的需要量，并且共培養可降低分化過程中出現的鈣化和肥大表型[3-6]，但是影響共培養系統中細胞增殖分化的因素和調節機制尚不明確，因此研究ACs和BMSCs接觸共培養方式對細胞增殖和分化的影響，可以優化共培養方式，對進一步探討共培養系統中BMSCs和ACs相互作用機制奠定基礎，為臨床應用組織工程學技術修復關節軟骨缺損提供理論支撐。

　　共培養系統中最佳的細胞比例是構建高質量組織工程化軟骨的關鍵因素。不同共培養條件下兩種細胞的最佳共培養比例尚未確定[7]。Kang等[8]研究表明ACs和BMSCs共培養中ACs的比例達到20%以上時，與同等數量單純ACs 構建的軟骨較為接近，當ACs達到一定數量時，增加ACs 的比例，BMSCs的誘導結果不發生改變，提示ACs對 BMSCs的誘導作用存在飽和現象，并且降低BMSCs在共培養系統中的比例，也會減少BMSCs對ACs的營養支持作用[9-10]。Meretoja等[11]研究表明1∶3的細胞比例既能維持 ACs的表型以及為BMSCs軟骨分化提供微環境，又能明顯減少ACs的用量，與Yao等[12]的研究結果一致。因此，該實驗以1∶3比例的ACs和BMSCs進行共培養實驗。

　　細胞接觸共培養和經Transwell非接觸共培養是不同的兩種共培養方式，Transwell培養瓶的隔離膜孔徑0.4 µm，僅能允許可溶性分子通過，而BMSCs和ACs不能自由通過，這就消除了細胞之間相互接觸的影響。實驗應用接觸和非接觸兩種共培養方式對BMSCs與ACs增殖、分化的影響進行了比較研究，結果表明：接觸共培養系統中糖胺多糖和轉化生長因子β3水平及COL2a1的表達均高于非接觸共培養，并且接觸共培養系統中ACs體積增大，核漿比例提高，提示ACs功能活躍，增殖速度快，甲苯胺藍染色及細胞免疫染色顯示有大量的軟骨陷窩形成和COL2a1的合成，說明接觸共培養明顯促進ACs的增殖和表型的維持， ACs的微環境誘導了BMSCs的軟骨分化。Cx43存在于多種類型的細胞中，正常軟骨組織和BMSCs均表達Cx43[13-15]， De Windt等[16]應用BMSCs和ACs進行共培養研究，結果表明BMSCs和ACs之間通過Cx43使兩種細胞建立了縫隙連接通道。此次研究檢測了共培養細胞的Cx43表達，結果表明接觸共培養細胞Cx43及COL2a1的表達明顯高于非接觸共培養細胞，說明Cx43參與了共培養細胞增殖和分化的調節[16]。

　　ACs和BMSCs共培養促進細胞增殖和分化的機制是活性因子的營養作用還是直接接觸的作用還存在爭議[10，16-17]。為消除兩種共培養系統中內生性轉化生長因子對細胞增殖和分化的影響，該實驗向ACs和BMSCs共培養系統中添加轉化生長因子β3進行比較研究，結果表明：接觸共培養細胞的增殖、糖胺多糖水平、COL2a1及Cx43的表達無明顯變化，說明接觸共培養細胞具有明顯的成軟骨活性和增殖能力，也側面證實了ACs和BMSCs接觸共培養不需要誘導因子的刺激。Dahlin等[18]在ACs和BMSCs共培養系統中應用不同質量濃度的轉化生長因子β3進行誘導共培養，結果表明應用1 μg/L或10 μg/L轉化生長因子β3共培養，共培養細胞產生同樣的糖胺多糖，與ACs或BMSCs單層培養比較，共培養有效降低了轉化生長因子β3的用量和時間，達到了同樣的軟骨分化水平;去除轉化生長因子β3 刺激后，共培養細胞的軟骨分化表型更穩定。因此，共培養系統的微環境提高了共培養細胞對生長因子反應的敏感性[19-20]。該研究添加轉化生長因子β3進行非接觸共培養，共培養細胞的增殖、糖胺多糖水平、COL2a1及Cx43的表達增強，但仍明顯低于未添加轉化生長因子β3的接觸共培養，說明細胞間直接接觸比轉化生長因子促進共培養細胞增殖和分化的作用更為重要，Cx43的表達水平影響了細胞的增殖和分化，與Zuo等[7]和De Windt等[16]的研究結果類似。Schrobback等[21]在人BMSCs和ACs共培養系統中添加 Cx43阻斷劑甘草次酸進行共培養，分析共培養細胞的軟骨分化潛能，結果表明BMSCs和ACs共培養期間經甘草次酸阻斷后，COL2和細胞外ATP減少及軟骨分化潛能下降，進一步證實了Cx43的表達水平決定了共培養細胞的增殖和分化。因此，應用外源性Cx43或其類似物可能為構建工程化軟骨提供新的策略[22-23]，但是具體的機制和詳細的信號傳導通路尚不清楚，需要進一步研究。

　　綜上所述，ACs和BMSCs接觸共培養能夠明顯促進細胞的增殖和分化，細胞間縫隙連接參與了共培養細胞增殖分化的調節，Cx43起到了重要作用。

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