發(fā)布時(shí)間：2020-02-22所屬分類：醫(yī)學(xué)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要背景：組織工程骨為修復(fù)極限骨缺損提供了新的選擇，但只有先形成完善的功能性血管網(wǎng)，保證穩(wěn)定的成骨和骨整合，才能取得良好的治療效果。因此，血管化可以說是組織工程骨面臨的最大挑戰(zhàn)與難題。目的：探討體外聯(lián)合應(yīng)用血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothel
摘要背景：組織工程骨為修復(fù)極限骨缺損提供了新的選擇，但只有先形成完善的功能性血管網(wǎng)，保證穩(wěn)定的成骨和骨整合，才能取得良好的治療效果。因此，血管化可以說是組織工程骨面臨的最大挑戰(zhàn)與難題。目的：探討體外聯(lián)合應(yīng)用血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)和血小板衍生生長(zhǎng)因子BB(platelet-derivedgrowthfactor-BB，PDGF-BB)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成血管能力的影響。方法：體外分離培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，分別用不同質(zhì)量濃度VEGF(20，40，60，80，100，120μg/L)、PDGF-BB(20，40，60，80，100，120μg/L)聯(lián)合干預(yù)以及100μg/LVEGF單獨(dú)干預(yù)、100μg/LPDGF-BB單獨(dú)干預(yù)，CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)2種細(xì)胞因子促進(jìn)細(xì)胞增殖的最佳質(zhì)量濃度，然后在第7天和第14天通過RT-PCR方法檢測(cè)血管生成素1、缺氧誘導(dǎo)因子1α、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子等相關(guān)成血管基因的表達(dá)量。結(jié)果與結(jié)論：①加入生長(zhǎng)因子后，細(xì)胞增殖能力明顯提高，聯(lián)合作用效果更優(yōu)，最佳組合為80μg/LVEGF+80μg/LPDGF-BB;②VEGF、PDGF-BB都可以促進(jìn)血管生成素1、缺氧誘導(dǎo)因子1α、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和胰島素樣生長(zhǎng)因子的mRNA表達(dá)，聯(lián)合應(yīng)用時(shí)效果最佳;③缺氧誘導(dǎo)因子1α、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子mRNA表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)有所升高，差異有顯著性意義(P<0.05);而血管生成素1、胰島素樣生長(zhǎng)因子mRNA表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)有所降低，差異有顯著性意義(P<0.05);④體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，當(dāng)VEGF和PDGF-BB質(zhì)量濃度均為80μg/L時(shí)，能夠持續(xù)穩(wěn)定促進(jìn)整個(gè)血管形成過程，且促進(jìn)作用優(yōu)于單獨(dú)一種生長(zhǎng)因子。
關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;血小板衍生生長(zhǎng)因子BB;組織工程骨;血管化
0引言Introduction
口腔頜面部大段骨缺損修復(fù)一直是口腔臨床治療的難題[1]。組織工程骨的問世為修復(fù)極限骨缺損提供了新的選擇，然而在臨床應(yīng)用過程中，只有先形成完善的功能性血管網(wǎng)克服擴(kuò)散限制[2]，保證穩(wěn)定的成骨和骨整合，才能取得良好的臨床治療效果[3]。因此，血管化可以說是組織工程骨面臨的最大挑戰(zhàn)與難題[4]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是目前促血管生成能力最強(qiáng)的生長(zhǎng)因子，多位學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)大劑量使用外源性VEGF時(shí)可有效促使內(nèi)皮細(xì)胞通過芽生方式連結(jié)為血管內(nèi)膜腔，但是其促生的血管結(jié)構(gòu)較為幼稚，缺乏成熟血管的基底膜和周細(xì)胞[5]。血小板衍生生長(zhǎng)因子BB(platelet-derivedgrowthfactor-BB，PDGF-BB)是強(qiáng)力促分裂劑，作用于管周細(xì)胞，能促進(jìn)血管成熟[6]。二者單獨(dú)作用都對(duì)血管化起推動(dòng)作用，然而聯(lián)合使用研究較少，且對(duì)于聯(lián)合應(yīng)用后相互拮抗還是相互促進(jìn)用，一直存在爭(zhēng)議[7];另一方面，聯(lián)合應(yīng)用生長(zhǎng)因子促進(jìn)成血管時(shí)，其合適的比例及作用濃度也非常重要[8]。
期刊推薦：《分子細(xì)胞生物學(xué)報(bào)》是1936年由中國(guó)科學(xué)院、上海生命科學(xué)研究院等單位主辦的期刊。主要刊登分子細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域,包括細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、生殖生物學(xué)、腫瘤生物學(xué)和免疫生物學(xué)等方面的創(chuàng)新性研究論文、研究簡(jiǎn)報(bào)和特約綜述等,為中國(guó)自然科學(xué)核心期刊之一。
該研究聯(lián)合應(yīng)用不同質(zhì)量濃度VEGF和PDGF-BB對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，旨在研究二者對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及成血管的影響，并確定最佳質(zhì)量濃度組合，希望能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生更加成熟穩(wěn)定的血管網(wǎng)，遴選更加優(yōu)質(zhì)的組織工程骨種子細(xì)胞。
1材料和方法Materialsandmethods
1.1設(shè)計(jì)隨機(jī)對(duì)照細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
1.2時(shí)間及地點(diǎn)實(shí)驗(yàn)于2017年12月至2019年5月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心完成。
1.3材料
1.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠20只，3周齡，雌雄不限，體質(zhì)量40-50g，由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物中心提供。1.3.2實(shí)驗(yàn)試劑和儀器α-MEM(Hyclone，美國(guó));PDGF-BB(R&D，美國(guó));VEGF(PERROTECH，美國(guó));CCK-8(DOJINDO，日本);倒置相差顯微鏡以及照相系統(tǒng)(萊卡，德國(guó));酶聯(lián)免疫儀(THERMOFISHERSCIENTIFIC，美國(guó));RT-PCR儀(BIO-RAD，美國(guó));QuantiFast®SYBR®GreenPCRKit(QIAGEN公司，德國(guó));胎牛血清(四季青，中國(guó))。
1.4實(shí)驗(yàn)方法
1.4.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)SD大鼠脫頸后處死，取股骨及脛骨，剪去骨骺端，反復(fù)沖洗骨髓腔，收集骨髓沖洗液，離心后棄上清，加入α-MEM培養(yǎng)液均勻分裝至T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，3d后換液，7d傳代。取狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞消化制成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)備用。
1.4.2實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)取第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以2×105密度接種于6孔板，每孔2.5mL;以2×103密度接種于96孔板，每孔0.1mL。用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁，吸棄原培養(yǎng)基，換成含不同質(zhì)量濃度細(xì)胞因子及體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液，此后每隔3d半量換液，每隔7d全量換液，每次換液均重新補(bǔ)充相應(yīng)體積的生長(zhǎng)因子，其中實(shí)驗(yàn)1組加入100μg/LVEGF;實(shí)驗(yàn)2組加入100μg/LPDGF-BB;實(shí)驗(yàn)3組加入20μg/LVEGF+20μg/LPDGF-BB;實(shí)驗(yàn)4組加入40μg/LVEGF+40μg/LPDGF-BB;實(shí)驗(yàn)5組加入60μg/LVEGF+60μg/LPDGF-BB;實(shí)驗(yàn)6組：加入80μg/LVEGF+80μg/LPDGF-BB;實(shí)驗(yàn)7組加入100μg/LVEGF+100μg/LPDGF-BB;實(shí)驗(yàn)8組加入120μg/LVEGF+120μg/LPDGF-BB;對(duì)照組加入同等體積PBS。
1.5主要觀察指標(biāo)
1.5.1CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖率細(xì)胞因子干預(yù)24h后，取1個(gè)96孔板進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)，棄去原培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，加入用a-MEM培養(yǎng)基稀釋的10%CCK-8溶液，每孔100μL，37℃孵育4h，450nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度值，確定細(xì)胞生長(zhǎng)因子促骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的最佳質(zhì)量濃度。每組4個(gè)樣本，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。接下來每天于固定時(shí)間取1個(gè)96孔板，在同一臺(tái)酶聯(lián)免疫儀上測(cè)吸光度值，確定細(xì)胞生長(zhǎng)因子促骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的最佳作用時(shí)間。
1.5.2細(xì)胞形態(tài)觀察倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)及排列有無變化。
1.5.3RT-PCR檢測(cè)成血管基因表達(dá)細(xì)胞因子干預(yù)第7，14天，采用RT-PCR檢測(cè)成血管基因血管生成素1、缺氧誘導(dǎo)因子1α、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和胰島素樣生長(zhǎng)因子的表達(dá)水平。參照PubmedGeneBank中的基因序列，設(shè)計(jì)相關(guān)基因引物，所有引物由上海生工公司合成。用TRIzol法提取RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度及純度。取待測(cè)樣品總RNA100ng，按照說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。將生成的cDNA稀釋成100mg/L，取2μL稀釋后的cDNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。配制成20μLPCR反應(yīng)體系：SYBRPremixExTaqⅡ(2×)10μL，F(xiàn)orwardPrimer1μL，ReversePrimer1μL，cDNA模板2μL，RNase-FreeddH2O6μL。PCR反應(yīng)條件為95℃、2min循環(huán)1次;95℃、5s循40次;60℃、10s循環(huán)40次，最后進(jìn)入熔解曲線。成血管基因引物序列，見表1。
1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以x_±s表示，確定最佳作用時(shí)間的4組細(xì)胞增殖率均數(shù)間比較采用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P<0.05為差異有顯著性意義;將成血管基因在第7天和第14天的表達(dá)量進(jìn)行重復(fù)測(cè)量檢驗(yàn)，若其滿足球?qū)ΨQ性時(shí)，采用重復(fù)測(cè)量的單變量方差分析法，否則采用球?qū)ΨQ系數(shù)ε對(duì)自由度進(jìn)行校正。
2結(jié)果Results
2.1確定細(xì)胞生長(zhǎng)因子促細(xì)胞增殖的最佳質(zhì)量濃度通過CCK-8試劑盒檢測(cè)不同質(zhì)量濃度生長(zhǎng)因子對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示聯(lián)合應(yīng)用2種生長(zhǎng)因子對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用最強(qiáng)，且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系，最佳組合為80μg/LVEGF+80μg/LPDGF-BB，繼續(xù)增加質(zhì)量濃度后細(xì)胞增殖率變化不大，見圖1。因此，采用100μg/LVEGF組、100μg/LPDGF-BB組、80μg/LVEGF+80μg/LPDGF-BB、對(duì)照組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
2.2確定細(xì)胞生長(zhǎng)因子促細(xì)胞增殖的最佳作用時(shí)間從圖2可以看出，對(duì)照組細(xì)胞增殖率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)僅有輕微增長(zhǎng)，第6天已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞增殖停滯期，第7天時(shí)細(xì)胞增殖率顯著下降;其他3個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞呈指數(shù)增長(zhǎng)，表現(xiàn)為較好的增殖活性，均在第6天時(shí)達(dá)到最佳的促增殖效果，提示細(xì)胞生長(zhǎng)因子促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖存在時(shí)間依賴效應(yīng)，第7天時(shí)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率均明顯降低，原因可能與細(xì)胞衰老退化性能降低以及細(xì)胞生長(zhǎng)因子存在半衰期有關(guān)。
在連續(xù)7d的觀測(cè)時(shí)間內(nèi)，除了第7天，其他時(shí)間點(diǎn)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖率均遠(yuǎn)超對(duì)照組。VEGF+PDGF-BB組促細(xì)胞增殖效率最好，PDGF-BB組次之，VEGF組最差。第5，6天時(shí)，VEGF+PDGF-BB組促細(xì)胞增殖效率明顯高于PDGF-BB組和VEGF組，PDGF-BB組與VEGF組無顯著差異。第7天時(shí)，VEGF組、PDGF-BB組、對(duì)照組細(xì)胞增殖率接近，而VEGF+PDGF-BB組細(xì)胞增殖率依然較高，結(jié)合前期閱讀的大量文獻(xiàn)，選取7d作為最佳時(shí)間點(diǎn)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
2.3骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)變化在倒置相差顯微鏡下觀察，最佳濃度生長(zhǎng)因子干預(yù)7d后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)向內(nèi)皮細(xì)胞分化：數(shù)量增多、體積變大、形態(tài)變長(zhǎng)、伸出圓凸?fàn)铋L(zhǎng)觸角[9]，開始時(shí)呈現(xiàn)聚集趨勢(shì)，然后逐漸呈點(diǎn)狀、條帶狀、橫向變寬并有縱向連接趨勢(shì)排列似漁網(wǎng)狀，以上均提示加入因子后細(xì)胞成管能力增強(qiáng)，見圖3。
2.4RT-PCR檢測(cè)成血管基因表達(dá)在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)，分別檢測(cè)血管生成素1、缺氧誘導(dǎo)因子1α、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和胰島素樣生長(zhǎng)因子這4個(gè)成血管相關(guān)基因表達(dá)量，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比成血管基因的表達(dá)均有所增加，差異有顯著性意義(P<0.05)，在以上4個(gè)成血管相關(guān)基因的mRNA表達(dá)上，VEGF主效應(yīng)、PDGF-BB主效應(yīng)、VEGF和PDGF-BB的交互效應(yīng)差異均有顯著性意義(P<0.05)。VEGF、PDGF-BB都可以促進(jìn)血管生成素1、缺氧誘導(dǎo)因子1α、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和胰島素樣生長(zhǎng)因子的mRNA表達(dá)，聯(lián)合應(yīng)用時(shí)促表達(dá)效果最佳。
通過重復(fù)測(cè)量方差分析對(duì)時(shí)間因分析發(fā)現(xiàn)：缺氧誘導(dǎo)因子1α、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子mRNA表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)有所升高，差異有顯著性意義(P<0.05);而血管生成素1、胰島素樣生長(zhǎng)因子mRNA表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)有所降低，差異有顯著性意義(P<0.05)，結(jié)果見表2-4。
3討論Discussion.
種子細(xì)胞是骨組織工程研究中最基本的環(huán)節(jié)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用十分普遍，也是促血管化的優(yōu)選細(xì)胞，具有較強(qiáng)的自我增殖及分化能力，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化、遷移性能最好[10]。實(shí)驗(yàn)選用第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，避開了內(nèi)皮祖細(xì)胞易于老化、培養(yǎng)成本低、形成血管不穩(wěn)定等缺點(diǎn)[11]。
運(yùn)用基因工程技術(shù)及基因轉(zhuǎn)染技術(shù)對(duì)種子細(xì)胞進(jìn)行特定改造，為達(dá)到精確表達(dá)促血管生長(zhǎng)因子提供新路徑，然而其技術(shù)敏感性高、安全性及有效性缺乏長(zhǎng)期觀察[12]。因此，實(shí)驗(yàn)采取直接滴入的方法加入VEGF和PDGF-BB這2種促血管生長(zhǎng)因子，細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞因子相互作用后，微觀上引起特定基因表達(dá)發(fā)生變化，合成特異性蛋白;宏觀上，在原血管結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上長(zhǎng)出新血管[13]。此方法簡(jiǎn)單、實(shí)用，經(jīng)證實(shí)安全且有效。
鑒于在聯(lián)合使用生長(zhǎng)因子時(shí)，其濃度和比例不同，可以產(chǎn)生截然相反的效果。細(xì)胞增殖能力很大程度上決定了種子細(xì)胞發(fā)揮效能的程度。實(shí)驗(yàn)通過CCK-8法檢測(cè)不同質(zhì)量濃度生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞增殖的影響，試圖篩選出2種生長(zhǎng)因子促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的最佳質(zhì)量濃度組合使其發(fā)揮最大效能，并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。大量查閱文獻(xiàn)后，得出單一應(yīng)用VEGF或PDGF-BB最佳質(zhì)量濃度是100μg/L[14-15]，該實(shí)驗(yàn)依次選取20-120μg/L質(zhì)量濃度，結(jié)果顯示：VEGF和PDGF-BB均能促進(jìn)細(xì)胞增殖，聯(lián)合應(yīng)用效果最佳，存在濃度效應(yīng)關(guān)系，最佳組合為：80μg/LVEGF+80μg/LPDGF-BB。
血管形成是多種生長(zhǎng)因子共同調(diào)控的結(jié)果，血管內(nèi)皮細(xì)胞形成相關(guān)的信號(hào)通路包括：VEGF信號(hào)通路、PDGF-BB信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路等[16]。VEGF、PDGF-BB的表達(dá)受諸多因素調(diào)節(jié)，近20年對(duì)于VEGF信號(hào)通路研究較多，該實(shí)驗(yàn)直接加入這2種效果最為顯著且是研究熱點(diǎn)的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，研究對(duì)其他成血管特異性指標(biāo)的影響。缺氧誘導(dǎo)因子1α是調(diào)節(jié)低氧狀態(tài)下多種平衡的中心環(huán)節(jié)，幾乎介導(dǎo)多細(xì)胞動(dòng)物所有有核細(xì)胞對(duì)缺氧或缺血的適應(yīng)性反應(yīng)，能夠調(diào)節(jié)包括VEGF在內(nèi)的下游基因，促進(jìn)早期血管形成[17]。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表達(dá)是血管形成前中期的重要標(biāo)志性蛋白，通過減少纖維形成促進(jìn)血管形成[18]。胰島素樣生長(zhǎng)因子1主要存在于骨基質(zhì)和長(zhǎng)骨的生長(zhǎng)面中，是骨形成過程中的調(diào)控因子，除了能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化，亦能通過上調(diào)VEGF的表達(dá)從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷徙、管型形成，也是血管形成中后期的標(biāo)志性蛋白[19]。血管生成素1在介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用中起關(guān)鍵作用，并在血管形成的后期階段和血管重塑階段參與血管生成，促進(jìn)血管重塑、成熟，有明確的成血管作用，為血管形成末期特異指標(biāo)[20]。以上都是成血管的特異性指標(biāo)，血管形成時(shí)mRNA的表達(dá)量均會(huì)上調(diào)，分別代表不同時(shí)期血管形成的程度。因此，在加入外源性VEGF和PDGF-BB后，通過檢測(cè)細(xì)胞外環(huán)境中缺氧誘導(dǎo)因子1α、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子和血管生成素1的mRNA表達(dá)，能夠反映骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的血管化程度。缺氧誘導(dǎo)因子1α、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子和血管生成素1mRNA表達(dá)上調(diào)，反過來又勢(shì)必會(huì)影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)VEGF和PDGF-BB，內(nèi)源性加上外源性VEGF和PDGF-BB同時(shí)增加，形成一個(gè)良性循環(huán)。
從加入VEGF及PDGF-BB到其對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成血管調(diào)節(jié)功能發(fā)揮作用需要一定的時(shí)間，基因表達(dá)發(fā)生變化一般7-14d就能體現(xiàn)，因此選擇7，14d這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)成血管特異性指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，缺氧誘導(dǎo)因子1α、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子和血管生成素1表達(dá)均上調(diào)，說明VEGF和PDGF-BB對(duì)血管形成的整個(gè)階段都起到持續(xù)的促進(jìn)作用。與第7天相比，第14天時(shí)所有成血管指標(biāo)并不都上調(diào)，而是有增有減，又有潛在規(guī)律可循：早中期成血管指標(biāo)缺氧誘導(dǎo)因子1α和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)進(jìn)一步增加，而中后期特異性成血管指標(biāo)胰島素樣生長(zhǎng)因子和血管生成素1表達(dá)稍降低，這也提示14d時(shí)血管形成仍處于早中期，尚未形成成熟血管網(wǎng)，與以往研究結(jié)論相符，以上現(xiàn)象都能通過復(fù)雜的成血管信號(hào)通路得到解釋[21]。
綜上所述，實(shí)驗(yàn)證明聯(lián)合應(yīng)用VEGF和PDGF-BB能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，證實(shí)二者是相互促進(jìn)的，加入PDGF-BB能促進(jìn)VEGF調(diào)控形成的幼稚血管逐漸改建形成成熟功能血管網(wǎng)。當(dāng)VEGF和PDGF-BB質(zhì)量濃度均為80μg/L時(shí)，能夠持續(xù)穩(wěn)定促進(jìn)整個(gè)血管形成過程，且促進(jìn)作用優(yōu)于單一應(yīng)用一種生長(zhǎng)因子，為精確使用生長(zhǎng)因子的質(zhì)量濃度和時(shí)間提供了一定參考依據(jù)。然而，成血管是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，不同階段需要的因子不同，是多種生長(zhǎng)因子序貫參與、聯(lián)合作用的結(jié)果。為了真正模擬體內(nèi)真實(shí)環(huán)境，是否還需要在特定階段加入其他某種或某些因子共同作用以及新的最佳質(zhì)量濃度組合仍有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究，實(shí)驗(yàn)只檢測(cè)7，14d2個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)，后續(xù)還應(yīng)該增加代表血管形成早期和后期的時(shí)間點(diǎn)，以便觀察到更加完整的血管形成動(dòng)態(tài)變化過程和基因表達(dá)的波動(dòng)變化。除了時(shí)間，空間對(duì)于血管形成的調(diào)控作用也尤為重要，有待后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)繼續(xù)探討。此外，VEGF和PDGF-BB上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1α、胰島素樣生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管生成素1基因表達(dá)的機(jī)制仍有待深入研究。
