發布時間：2019-10-25所屬分類：醫學論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：苦馬豆素(swainsonine, SW)是有毒的吲哚里西啶類次生代謝產物，它可抑制-甘露糖苷酶活性，使動物中毒，還具有抗腫瘤和免疫調節作用，成為關注熱點。文章綜述了豆類絲核菌、金龜子綠僵菌、瘋草內生真菌和稻瘟病菌四類真菌中苦馬豆素的生物合成途徑及所
摘要：苦馬豆素(swainsonine, SW)是有毒的吲哚里西啶類次生代謝產物，它可抑制α-甘露糖苷酶活性，使動物中毒，還具有抗腫瘤和免疫調節作用，成為關注熱點。文章綜述了豆類絲核菌、金龜子綠僵菌、瘋草內生真菌和稻瘟病菌四類真菌中苦馬豆素的生物合成途徑及所涉及的調控酶的研究進展，旨在為揭示真菌合成苦馬豆素途徑中的未知細節提供參考，對于瘋草的綜合治理及苦馬豆素的應用有積極意義。
關鍵詞：苦馬豆素;生物合成;真菌
國際上將含苦馬豆素(swainsonine, SW)的豆科棘豆屬(Oxytropis glabra DC.)和黃芪屬(Astragalus) 植物統稱為瘋草，瘋草是目前危害草原畜牧業最嚴重的毒草類型[1-2]。牲畜采食瘋草到一定劑量后會引發病變，獸醫毒理學家稱之為瘋草病。SW (C8H15NO3)是引起動物瘋草病的唯一毒素[3]，其陽離子半椅式構象類似于甘露糖陽離子，能與甘露糖苷競爭性結合，抑制α-甘露糖苷酶Ⅰ和高爾基體α-甘露糖苷酶Ⅱ的活性，使牲畜細胞空泡變性，失去正常功能，中毒嚴重者死亡[4-7]。在醫學領域，苦馬豆素被作為研究糖蛋白N-寡糖合成的工具藥，20世紀80年代發現苦馬豆素具有抗腫瘤和免疫調節作用，被廣泛關注[8-13]。2006年我國學者完成了苦馬豆素抗癌新型醫藥制劑“棘豆扶正膠囊”[蘭制字(2006)F68104]的藥學、藥理和抗輻射研究，現已應用于癌癥的治療[14]。
目前已知生物有棘豆屬(Oxytropis)、黃芪屬 (Astragalus)、牽牛屬(Pharbitis)、里韋亞屬(Turbina) 的一些物種及錦葵科的Sida carpinifolia均檢測到苦馬豆素。Braun等[15]從美國3種植物(Oxytropis lambertii、Oxytropis sericea和Astragalus mollisimus)分離培養出產苦馬豆素的Alternaria內生真菌;盧萍[5] 從內蒙古小花棘豆(Oxytropis glabra)中分離培養出產苦馬豆素的Embellisia內生真菌(后變更為Alter-naria)。國際上將棘豆屬、黃芪屬等有毒植物統稱為瘋草，故將這類合成苦馬豆素的內生真菌稱為瘋草內生真菌[16]。除此之外，豆類絲核菌(Rhizoctonia legumimicola)、金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)和稻瘟病菌(Magnaporthe)也可合成苦馬豆素。本文主要對R.legumimicola、M.anisopliae、 A.oxytropis和Magnaporthe中苦馬豆素的生物合成途徑研究進展進行綜述。
1 豆類絲核菌中的苦馬豆素合成代謝
豆類絲核菌(Rhizoctonia legumimicola)是擔子菌類(Basidiomycete)無孢菌群(Myceliasterilia)絲核菌屬(Rhizoctonia)病原真菌[17-18]，廣泛寄生于大豆、苜蓿、紅三葉等牧草中，動物采食侵染植物引發中毒[19-20]。起初認為毒性化合物是根霉菌胺 (又稱流涎胺)，它是賴氨酸和哌啶酸的代謝產物，后通過標記哌啶酸的[R-3H]發現，除根霉菌胺外，哌啶酸的代謝產物還有另一種弱堿性生物堿。Broquist等[21]通過分離鑒定該生物堿確定為苦馬豆素，根霉菌胺及苦馬豆素兩種生物堿都屬于吲哚里西啶類。
Harris等[22-24]推測，在產苦馬豆素的豆類絲核菌中由賴氨酸到哌啶酸合成的途徑為：L-賴氨酸 →酵母氨酸→α-氨基己二酸半醛→6-羧基-哌啶酸 (△1-piperidine-6-carboxylate，P6C)→哌啶酸(別稱：六氫吡啶羧酸或哌可酸)，Wickwire等[25]提出哌啶酸的直接前體為P6C，推測苦馬豆素可能的合成途徑是：L-賴氨酸在哌啶酸脫氫酶作用下生成酵母氨酸，酵母氨酸經酵母氨酸還原酶催化生成α- 氨基己二酸半醛(酵母氨酸還原酶熱穩定性差，46 ℃ 失活，能催化雙向反應，pH為中性時向正反應方向還原生成酵母氨酸;pH為堿性時向逆反應方向脫氫生成谷氨酸[21])，α-氨基己二酸半醛經構型改變生成P6C，又在6-羧基-哌啶酸還原酶催化下生成哌啶酸，哌啶酸和丙二酸反應生成乙酸哌啶，還原環化后生成1-酮基-吲哚里西啶，1-酮基-吲哚里西啶在還原酶作用下生成(1R，8aS)-羥基吲哚里西啶和(1S，8aS)-羥基吲哚里西啶，經兩次羥化反應，(1R，8aS)-羥基吲哚里西啶形成苦馬豆素，而 (1S，8aS)-羥基吲哚里西啶形成根霉菌胺。豆類絲核菌中根霉菌胺和苦馬豆素合成途徑如圖1所示。
2 金龜子綠僵菌中的苦馬豆素合成代謝
Sorokin建立綠僵菌屬，但由于不同學者采用標準有區別，其分類較混亂。目前國際上普遍接受的分類觀點由Tulloch[26]提出，綠僵菌屬有2個種，即金龜子綠僵菌和黃綠綠僵菌，金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)包括小孢變種和大孢變種，均可合成苦馬豆素[27]。
Sim等[18]推測苦馬豆素以L-賴氨酸為前體，在酵母氨酸還原酶作用下生成酵母氨酸，酵母氨酸在酵母氨酸氧化酶作用下氧化生成哌啶酸或α-酮戊二酸，α-酮戊二酸經一系列反應生成α-氨基已二酸半醛，再通過非酶促環化反應形成哌啶酸，由哌啶酸轉化為苦馬豆素[29]。在豆類絲核菌中生成苦馬豆素的直接前體物是1-酮基-吲哚里西啶，反應過程中有兩個分支，最終形成兩種產物;而在金龜子綠僵菌中無分支，但生成哌啶酸有兩條途徑。綠僵菌中苦馬豆素合成途徑如圖2。
3 瘋草內生真菌中苦馬豆素合成代謝
Braun等[15]從美國三種瘋草(Oxytropis lambertii、Oxytropis sericea和Astragalus mollisimus)分離培養出產苦馬豆素內生真菌。盧萍等[5]在小花棘豆 O. glabra中分離出內生真菌，體外培養后合成了苦馬豆素，未檢測到該內生真菌的宿主植物都不含苦馬豆素，因此提出苦馬豆素由該內生真菌產生，當時鑒定為Embellisia，Pryor等[30]將Embellisia oxytropis修訂為Undifilum oxytropis，之后Woudenberg等[18]又修訂為Alternaria oxytropis，亦稱瘋草內生真菌。本課題組培養出的小花棘豆內生真菌Alternaria oxytropis形成白色絨毛狀、邊緣整齊的菌落，中間有隆起，分泌黑色素，菌落顏色最初是白色，逐漸變為灰色，最終為黑色。
酵母氨酸還原酶是內生真菌生物合成苦馬豆素的關鍵酶之一，Mukherjee等[31]在美國瘋草內生真菌中敲除該基因，發現敲除突變株里苦馬豆素及其前體物哌啶酸的含量增加，而酵母氨酸和賴氨酸含量降低，推測酵母氨酸還原酶基因失活導致真菌突變株里哌啶酸及其前體的積累，使苦馬豆素含量增加，酵母氨酸還原酶的活性影響了苦馬豆素合成。
盧萍課題組克隆到小花棘豆內生真菌Embellisia (修訂為Alternaria)酵母氨酸還原酶cDNA全長序列 (KJ944635)和基因序列(KY052048)，與Braun等[15] 的美國瘋草內生真菌的酵母氨酸還原酶基因序列進行比對分析，一致度為82.3%，構建了基因缺失載體，轉化至原生質體再生和篩選，得酵母氨酸還原酶基因敲除突變株[13]。利用不同培養基[32]或在培養基添加酵母氨酸、α-氨基己二酸、賴氨酸和哌啶酸[33]，比較不同培養時間野生株和突變株中苦馬豆素合成動態變化，發現野生株的苦馬豆素含量高于突變株，但賴氨酸含量變化不大，酵母氨酸還原酶基因的確影響真菌的苦馬豆素合成，但影響的結果與Mukherjee等[31]的結果有區別，其中哌啶酸作用最大。突變株中苦馬豆素生成量低于野生株，而賴氨酸含量在兩種菌株變化不大，推測是由于酵母氨酸還原酶基因缺失使酵母氨酸和賴氨酸合成受阻，鑒于賴氨酸是必需氨基酸，酵母氨酸是賴氨酸合成的前體，可能需要從逆反應方向在酵母氨酸氧化酶催化下，使P6C轉變成酵母氨酸，再合成賴氨酸，使其含量保持在一定水平，以維持真菌的正常生命活動。同時苦馬豆素也是由P6C轉化而來，但其最為一種次生代謝產物并非機體所必需，故其含量在突變株中降低。
楊國棟等[16]用碳氮標記(C12，N15的α位)賴氨酸做示蹤試驗，發現標記的C12和N15轉移到哌啶酸和苦馬豆素。研究瘋草內生真菌苦馬豆素合成時，張蕾蕾等[34]在液體培養基添加L-賴氨酸、哌啶酸、α-酮戊二酸及聚乙二醇等化合物，均對內生真菌生長和菌絲苦馬豆素產量影響顯著;在固體培養基中添加賴氨酸、哌啶酸、α-氨基己二酸等化合物，研究苦馬豆素動態合成，發現哌啶酸對苦馬豆素合成影響最大，且在菌落的不同生長時期，苦馬豆素合成量變化趨勢呈拋物線，在29 d達到最高[33]。近期有研究推測苦馬豆素生物合成途徑可能有兩條，即P6C途徑和P2C途徑[35-37]。在 P6C途徑中，L-賴氨酸→酵母氨酸→α-氨基己二酸半醛的反應均在酵母氨酸脫氫(saccharopine dehydrogenase，SDH)催化下進行;α-氨基己二酸半醛在酵母氨酸氧化酶(saccharopine oxidase，FAP2)作用下生成P6C，逆反應在SDH作用下進行;P6C在吡咯啉-5-羧酸還原酶(pyrroline-5-carboxylate reductase，P5CR)作用下生成哌啶酸，逆反應在哌啶酸氧化酶(L-pipecolate oxidase，PIPOX)作用下進行; 1-酮基-吲哚里西啶是酮類化合物，推測哌啶酸可能在聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)催化下變為1-酮基-吲哚里西啶，最后可能通過P450家族酶 (cytochrome P450)催化生成苦馬豆素，PKS和P450 是調控次級代謝和非核糖體多肽合成的關鍵酶，種類眾多，作用機理多樣[38-39]，它們在苦馬豆素合成途徑中的作用機制還需深入探索。P2C途徑是新近推測的另一條苦馬豆素生物合成途徑，由L-賴氨酸→α-己酮酸→P2C→哌啶酸→1-酮基-吲哚里西啶→苦馬豆素，該途徑涉及的酶尚不清楚，需深入研究。瘋草內生真菌苦馬豆素部分代謝如圖3。
4 稻瘟病菌中苦馬豆素的合成
子囊菌(Magnaporthe oryzae)，能引起水稻稻瘟病，這是一種突發性強、易于流行的水稻重要病害之一，對水稻危害極大[40]。目前關于Magnaporthe的報道多集中對水稻稻瘟病的研究，而關于其苦馬豆素生物合成途徑研究報道極少。Cook 等[41]通過使用靶向苦馬豆素的基因簇比較基因組分析發現稻瘟病菌中一同源基因簇與苦馬豆素的合成有關，命名為“SWN”。該基因簇包含swnK (PKS-NRPS multifunctional enzyme gene)、swnN (an NmrA-like，NADB Rossmann-fold reductase gene)、swnR(an NADB Rossmann-fold reductase gene)、swnH1(2-oxoglutaratedependent dioxidase gene)、swnH2(Fe(II)-dependat dioxidase gene)、 swnA(Amino transferase gene)和swnT(Transmembrane choline transporter gene)等結構域，后利用同源重組的方法敲除該基因簇，得到缺失突變體 ΔswnK。研究發現突變體不產苦馬豆素，互補株恢復了苦馬豆素生物合成，認為“SWN”與苦馬豆素生物合成密切相關。
5 展望
目前，有關真菌苦馬豆素生物合成途徑大多由S.leguminicola和M.anisopliae的研究中得出，但近年來對其苦馬豆素合成的研究停滯不前，仍有許多未解之謎。最初A.oxytropis中的苦馬豆素生物合成途徑是由S.leguminicola和M.anisopliae推測而來的，近年來雖通過基因組學研究取得了部分成果，可依舊有許多細節未知[37-42]。
未來可通過高通量測序技術對苦馬豆素代謝途徑進行探索，篩選與苦馬豆素合成的相關基因，進行候選基因的敲除或過表達研究，獲得突變體，進一步細化瘋草內生真菌A.oxytropis的苦馬豆素生物合成途徑的各個步驟。另外，也可探索獲得使宿主有生長發育和抗逆性優勢、又不產苦馬豆素的內生真菌，對瘋草進行遺傳改良，促進草地生態系統的良性循環;還可構建苦馬豆素過表達真菌突變株，提取苦馬豆素用于癌癥治療和免疫調節。
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