轉錄組代謝組分析方法及其在藥物作用機理研究中的應用

發布時間：2019-10-19所屬分類：醫學論文瀏覽：1313次

摘 要： 摘 要 ： 隨著高通量測序技術的發展，目前高通量整合分析技術是獲取最終生物學信息必不可少的重要手段，是對傳統藥物作用機理研究方法的一次革命性變革。轉錄組學、代謝組學及二者聯合應用是系統生物學的重要組成部分，近年來廣泛應用在藥物作用機理研究相關

　　摘 要 ： 隨著高通量測序技術的發展，目前高通量整合分析技術是獲取最終生物學信息必不可少的重要手段，是對傳統藥物作用機理研究方法的一次革命性變革。轉錄組學、代謝組學及二者聯合應用是系統生物學的重要組成部分，近年來廣泛應用在藥物作用機理研究相關的各個領域，如新藥開發、提高藥效和評價藥物毒性、指導藥物聯合治療等方面，已成為研究藥物作用機理中不可或缺的篩選階段。同時對轉錄組學、代謝組學、四種轉錄組 - 代謝組聯合分析方法進行了綜述，對不同聯合分析方法的優缺點及存在的問題進行簡要分析，闡述了近幾年兩組學聯合分析方法在藥物作用機理研究中的應用，展望其下一步的發展前景與挑戰，以期探討轉錄組學和代謝組學及其二者聯合應用在藥物作用機制研究中的策略，為今后藥物作用的分子機理研究提供借鑒與參考，進而基于現有研究基礎發掘新的研究方法與途徑。

　　關鍵詞 ： 轉錄組學 ;代謝組學 ;轉錄組 - 代謝組聯合分析方法 ;藥物作用機理

　　藥物作用機理的研究在新藥開發、提高藥效和評價藥物毒性、指導藥物聯合治療等方面具有重要作用。目前，研究藥物作用機理大多靠傳統藥理學方法[1]，然而這些傳統的策略在研究中具有局限性，主要集中在表觀遺傳學和形態學觀察或僅僅是分子靶點的鑒定等[2]。隨著高通量測序技術的發展，使用組學(Omics)這門新興技術采集生物學數據信息的方法越來越普遍。早期的研究傾向于僅使用一種組學來分析研究[3-4]，然而，越來越多的對于藥物作用機理的研究正在利用多組學聯合的技術手段開展[5-6]。多組學聯合分析的主要優勢是通過這些整合的數據可以更好地分析生物體內發生的細微變化，為預測生物體作用功能靶點提供更可靠的數據支撐。雖然在不同的文獻中介紹過不同組學的研究方法，但由于價格低廉等優勢，在藥物作用機理研究中最常用的研究方法是轉錄組 - 代謝組聯合分析，這種方法和策略在研究藥物作用機理方面發揮著重要作用。近年來，許多研究人員利用轉錄組學、代謝組學對藥物作用機理進行了大量的研究并且取得了一定的成果[6]。現今，轉錄組 - 代謝組聯合分析已廣泛用于探索藥物作用機制的研究，本文主要從轉錄組學概念、代謝組學概念、轉錄組 - 代謝組聯合分析概念及聯合分析的方法出發，闡述它們在藥物作用機理研究中的應用，目的是探討轉錄組學和代謝組學及其二者聯合應用在藥物作用機制研究中的策略，從而不僅為今后藥物作用的分子機理研究提供借鑒與參考，并且希望能夠基于現有研究基礎發掘新的研究思路與方法。

　　1 轉錄組學

　　在完成人類基因組測序以及許多其他生物基因組測序后[7]，生命科學進入了后基因組時代，功能基因組學成為了目前研究的主流方法。轉錄組學(Transcriptomics)是功能基因組學的重要組成部分[8]。轉錄組學的研究對象是一種細胞或組織的基因組所轉錄出來的 RNA 的總和，其研究目的是確定基因的轉錄結構并解釋基因功能，從而揭示藥物在機體中作用的相關機制[9]。

　　轉錄組學的研究方法包括基因芯片技術(Microarray)和高通量 RNA 測序技術(RNA Sequencing， RNA-Seq)[10]等。最初，研究人員通過雜交測序方法將數千個短 DNA 片段構建成基因芯片，并通過與芯片上的特定位點探針靶向雜交來檢測這些基因的表達。目前為止，大量的基因芯片研究在人們對生物變化過程的理解方面提供了實質性的幫助[11]，然而，由于其雜交靈敏度有限，很難檢測出低豐度的 mRNA。另一種轉錄譜分析方法是基于高通量測序儀的發展而出現的 RNA-Seq，該方法引入了測序和轉錄本數字化的概念，通過隨機剪切的短 cDNA 序列測序，計算 mRNA 的表達量。相比于前者，RNASeq 對功能基因組研究非常有效，能夠檢測出組織或細胞樣品內全部基因表達譜。

　　這些轉錄組學方法為解釋生物學功能中基因表達差異及尋找藥物在機體中的作用靶點都提供了有力的技術支持。Ujihira 等[12]通過基因芯片鑒定了 11 種與他莫昔芬反應有關的小 RNA，其中之一是腫瘤抑制 miRNA，miR-574-3p。Kim 等[13]通過 RNASeq 研究了嗜油不動桿菌 DR1 的諾氟沙星耐藥性，分析了用諾氟沙星處理的 DR1 和 DR1 之間 RNA 的差異。以上兩項研究分別用了上述兩種方法，隨著科技發展，RNA-Seq 由于提高了檢測的特異性和準確性越來越受到學者們的青睞。轉錄組測序雖然可以得到大量差異表達基因和調控代謝通路，但由于基因與表型之間很難直接關聯，導致關鍵的藥物作用信號通路難以確定，因此往往很難達到預期的研究目的。

　　2 代謝組學

　　代謝組學(Metabolomics)是指定性定量測定活體系統內經病理生理刺激或遺傳修飾引起的動態變化的代謝物質[1]，近來廣泛應用于藥物毒理機制，疾病發生過程和藥物開發等研究領域，特別是在新藥開發領域具有深遠影響[14-20]。當藥物作用時，隨著時間的改變，機體內往往都伴隨著代謝物的微小變化，采用代謝組學現代分析技術，不僅可以測定這些微小變化的代謝物，并且通過對比代謝物可以發現特異性生物標記物。傳統方法如利用生化指標對藥物作用方式進行評價時，往往只局限于對特定物質進行檢測而忽略了藥物對機體的整體影響，難以準確反映生物系統對藥物作用引起的全面變化，如今利用代謝組學評價藥物對機體的作用能夠更加準確全面的反映生物系統整體的動態變化，通過對變化的代謝物進行測定，可為進一步闡明藥物作用的分子機制提供強大的數據支撐。

　　代 謝 組 學 分 析 方 法 包 括 核 磁 共 振(Nuclear magnetic resonance，NMR)[21]、液相色譜質譜聯用(Liquid chromatograph mass spectrometer，LCMS)[22]、氣相色譜質譜聯用(Gas chromatography mass spectrometer，GC-MS)[23] 等。 不 同 技 術 其 檢 測 偏向性不同，但不同平臺之間具有互補性。一般來說 NMR 的靈敏度最低，能檢測并定性的物質少于 100 個，其優勢是簡單、無損傷、可定量[24]等。質譜的靈敏度大概是 NMR 的千倍，GC-MS 可檢測的物質數量一般為 1 000 個以上，但由于對樣品要求比較嚴格，其應用受到了一定限制[25]。雖然 LC-MS 檢測物質的數量要比 GC-MS 少一些，但由于其避免了對樣品進行復雜的前處理等步驟，并且由于能夠方便的對樣本進行定性定量分析而深受大眾青睞[26]。近年來越來越多學者利用代謝組學手段研究外源物質在生物體內的作用機制。王喜軍等[27]通過代謝組學研究方法輔以生物化學鑒定方法闡明了茵陳蒿湯對酒精性肝病大鼠具有良好的保肝作用。查偉斌等[28]基于 GC-MS 檢測技術的代謝組學方法，研究銀杏提取物對高脂誘導動脈粥樣硬化引起的代謝紊亂的作用，闡明銀杏提取物抗動脈粥樣硬化效果與其對脂質代謝、膽酸合成及氨基酸代謝的調控密切相關。

　　然而，單一代謝組學方法并不足以闡述生物系統內發生的各種變化，其方法在很大程度上取決于 1H-NMR、MS[29]和色譜的發展，另外，許多學者傾向專注于某一循環系統代謝物的分析，但循環系統內的物質變化是許多生物系統共同反應的綜合結果，因此通過單一代謝組學研究并不能獲得對組織內產生的具體反應機制的全面闡述。另外，由于目前對代謝物種類分析的局限性，只依靠代謝組學研究結果難以對藥物作用機理進行全面的生物學解釋[30]。

　　推薦閱讀：發表植物轉錄組測序類文章的SCI期刊

　　SCI是國際期刊，對投稿論文要求極高，再加上語言差異，一般在SCI上發表論文的作者很少，所以研究植物的作者，對SCI期刊了解得不是很多。有想了解的作者，可以與期刊天空在線編輯聯系。

　　3 轉錄組-代謝組聯合分析方法

　　隨著高通量測序技術的完善和各種組學方法的成熟，不同組學的組合使用越來越受歡迎，然而研究過程中對于產生的大量數據進行分析是目前面臨的最大挑戰。通過整合不同組學數據來分析比較不同數據間的關系以及闡述綜合數據所說明的生物學問題才是最終研究目的，因此分析這些復雜數據的統計學工具必不可少。轉錄組 - 代謝組聯合分析(Transcriptome-metabolism conjoint analysis) 中， 有多種數據整合分析的方法，包括基于相關性分析將數據結合的方法、基于級聯的集成方法、基于多變量整合的分析方法和基于代謝通路數據庫來整合分析數據的方法，學者們可以根據不同的生物學研究目的確定不同的聯合分析手段[31]。

　　3.1 基于相關性分析將數據結合的方法

　　通過聯合分析手段探索多元數據的簡單方法之一是尋找數據集之間的相關性。這里有兩種常用的方法，其中最常見的是 Pearson’s 和 Spearman’s 相關分析方法[32]。雖然科學家們期望通過此種方法找到代謝物與基因之間的關聯，然而僅使用這種單一方法往往不足以達到預期目的。雖然人們普遍認為遵循中心法則的信息流動應該符合層層遞進的規律，然而 Kuile 和 Westerhoff[33]發現 mRNA 與其相應的代謝物之間并不符合預期的數量關系，并且 Moxley 等[34]也報道了酵母中轉錄物和代謝物之間的相關性非常低。

　　除了使用 Pearson's 或 Spearman's 等標準相關系數外，還有 Goodman 和 Kruskal 伽馬檢驗[35]，這種分析方法僅考慮每種代謝物或基因的上調或下調，如用線性模型僅通過轉錄組的變化預測相應代謝物變化趨勢[36]。事實上，直接利用相關系數來聯合分析兩組學數據存在一些潛在問題，分析過程中如果那些已知在路徑上密切相關的元素不表現出相關性，則我們需要通過其他的分析方法來給予輔助。

　　3.2 基于級聯的集成方法

　　基于數據級聯的集成方法是最早出現，且最簡單的方法之一，它可將多個組學數據集集合成單一模型。通過將每種組學技術產生的數據表匯總成單個數據表，應用自組織映射[37-38]、K 均值聚類分析[39]或隨機森林[40]等算法進行分析。Daub 等[41]介紹了一種在線軟件 MetaGeneAlyse，它可以通過運行上述標準方法來針對轉錄組 - 代謝組進行數據分析。代謝組和轉錄組數據集分別是從不同的分析技術中獲得的，其兩組數據集大小不一，這意味著數據集具有不同的標注模式與結構、不同的期望值、不同的底層噪聲分布和不同的方差，因此，從簡單連接的數據集中獲得代謝組和轉錄組數據之間的聯系并非易事。當對連接的數據集進行聚類時，來自不同數據集的元素將傾向于與其自身數據集中的其他元素聚類，從而可能會掩蓋組間關聯。

　　盡管需要進行更多的研究來彌補這些局限性，但使用諸如 iCluster[42]這樣的工具可將這些問題最小化，這些潛在的分布差異影響可以通過去除信號低甚至沒有信號的元素將噪音的影響最小化。雖然通過預處理完全消除這些影響是不可能的，但是可以結合本文中的其他方法對代謝組 - 轉錄組數據進行進一步分析，其結果的可信度會更高。

　　3.3 基于多變量的整合方法

　　除了前面描述的相對簡單的分析方法外，還可以利用多變量建模的方法進行轉錄組 - 代謝組聯合分析。這種方法在用于生物學分析之前常用于化學計量學領域。兩種最常見的多變量分析方法是主成 分 分 析(Principal component analysis，PCA) 和偏 最 小 二 乘 回 歸(Partial least squares regression， PLSR)[43-44]。通過這種分析，研究人員可以利用一個數據集來預測另一個數據集并且找到兩個數據集之間的“協方差”關聯。與上述分析方法不同的是，這種方法可以將代謝組學和轉錄組學數據集保持在模型內的獨立模塊中。

　　最早利用 PLS 模型整合代謝組數據和轉錄組數據的是 Griffin 團隊[45]。他們將兩組乳清酸處理大鼠的轉錄組與代謝組結合，用代謝組 NMR 光譜作為模型的 x 值，轉錄組數據作為待預測的 y 值，隨后他們通過模型找出了各種與基因相關的代謝物。這種建模方法解釋了乳清酸對于大鼠脂肪肝作用的相關代謝物，同時結果也表明 1H-NMR 與基因表達譜數據相結合的方法有利于挖掘復雜生物系統中發生的微小反應。這種模型同樣也被 Jauhiainen 等[46]以類似的方式預測轉錄譜中的相關代謝譜。在 Griffin 的方法中必須定義一種數據集作為 x，事實上這兩個數據集在模型中并非等價。因此，這種情況下，我們可以選擇更為泛化的評價方法，稱為 O2PLS[47]。正 交 偏最 小 二 乘 法 方 法(Orthogonal partial least squares，OPLS)是一種新發展起來的將正交信號校正方法與 PLSR 進行結合對 PLSR 進行修正的分析方法，而 O2PLS 是一種泛化的 OPLS，可在兩個數據矩陣中進行雙向建模和預測。在這個算法中，x 和 y 是等價的，所以無論分配哪個數據集作為 x 或 y 無關緊要。Eveillard 等[48]用這種方法檢測了內二(2- 乙基己基)鄰苯二甲酸酯暴露后的人體肝臟轉錄物和血漿代謝物。

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