發布時間：2021-09-28所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要:目的建立人血清不同形態碘的電感耦合等離子體質譜(inductivelycoupledplasmamassspectrometry，ICP-MS)檢測方法。方法四甲基氫氧化銨溶液稀釋血清后，在氦氣模式下建立碘的ICP-MS的檢測方法，測定總碘。血清加入甲醇溶液沉淀蛋白質，上清經液相色譜分離
摘要:目的建立人血清不同形態碘的電感耦合等離子體質譜(inductivelycoupledplasmamassspectrometry，ICP-MS)檢測方法。方法四甲基氫氧化銨溶液稀釋血清后，在氦氣模式下建立碘的ICP-MS的檢測方法，測定總碘。血清加入甲醇溶液沉淀蛋白質，上清經液相色譜分離后ICP-MS檢測，測定無機碘。結果ICP-MS血清I-檢出限為0.17μg/L，定量限為0.57μg/L，線性相關系數R2=0.9998;血清IO3-檢出限為0.16μg/L，定量限為0.55μg/L，線性相關系數R2=0.9998。血清總碘測定方法的I-回收率96.2%～104.5%，無機碘測定方法的I-回收率93.7%～98.6%。對實際血清樣品碘形態進行分析，I-含量2.6～12.2μg/L、有機碘含量45.3～66.0μg/L、血清樣本基本不含IO3-。結論利用高效液相色譜串聯電感耦合等離子體質譜建立了一種方便、高效、準確的碘形態分析方法，可測定血清碘形態及含量。
關鍵詞:碘元素電感耦合等離子體質譜法碘形態分析
碘是人體必需的微量元素，是合成甲狀腺激素必不可少的重要原料，其功能主要通過甲狀腺素的生理作用顯示，迄今尚未發現碘有除甲狀腺素以外的其他獨立生理作用。碘缺乏和過量均可損害健康，中國曾是世界上碘缺乏病分布廣泛、病情較嚴重的國家之一，20世紀90年代實施普遍食鹽加碘(universalsaltiodization，USI)政策前，全國1778個縣有碘缺乏病的流行，地方性甲狀腺腫病人776萬，典型的地方性克汀病患者18.8萬[1]。普遍食鹽加碘是我國防治碘缺乏病的基本國策，我國自1995年實施全民食鹽加碘以來，在預防和控制碘缺乏病方面取得了十分顯著的成績[2]。
人體攝入的碘主要來源于含碘食物及加碘鹽，我國加碘鹽中的碘主要是碘酸鉀(KIO3)。碘酸鹽被食物還原或在腸道轉變為碘化物后被吸收，在血液中游離至甲狀腺被攝取[3]，在甲狀腺存儲的碘將被合成甲狀腺激素以有機碘的形式存在，碘在體內發揮的生理作用與其具體形態有關。
當前碘元素的檢測方法主要有比色法[4]、氣相色譜法[5]、離子色譜法[6]、電感耦合等離子體質譜法[7](inductivelycoupledplasmamassspectrometry，ICP-MS)以及國家行業標準WS/T107.1—2016推薦使用的砷鈰催化分光光度法[8]，而大部分方法只能用于測定碘的總量，僅有ICP-MS法可用于分析樣本中碘的形態，歐盟發布的碘檢測方法標準即為ICP-MS法。ICP-MS技術將質譜儀快速靈敏的掃描優點與ICP的高溫電離特性相結合[9]，幾乎可以分析地球上的所有元素。本研究將建立高效液相色譜(highperformanceliquidchromatography，HPLC)-電感耦合等離子質譜聯用測定有機碘和碘離子的方法，并用以血清中碘元素形態分布的檢測。
1材料與方法
1.1儀器和試劑
電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS，8800，Agilent，美國);高效液相色譜儀(HPLC，1260，Agilent，美國)，臺式冷凍高速離心機(5810R，Eppendorf，德國);超純水系統(Milli-QElementA10，Millipore，德國)，萬分之一電子天平(XR205SM-DR，Precisa，德國)。
碘酸鉀(KIO3，10g，Aldrich，美國)，碘化鉀(KI，5g，Aldrich，美國)，硝酸(Merck，德國)，四甲基氫氧化胺溶液(TMHA，25%，ANPEL，中國)，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、氫氧化鈉(NaOH)、硫酸鈉(Na2SO4)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)購自國藥集團化學試劑有限公司，銦標準品(In，1000μg/mL，Agilent，美國)。
1.2樣品預處理
1.2.1總碘取血清樣品0.2mL，置于離心管中，用1%TMHA定容至10mL，渦旋混勻后待測。
1.2.2無機碘取血清樣品0.2mL，加入0.8mL甲醇，震蕩混勻，-20℃冷凍過夜，沉淀血漿中蛋白質。12000r/min離心15min，取全部上清液，用高效液相色譜流動相定容至1mL，待測。
1.2.3標準液配制分別準確稱量KIO3和KI各0.0500g，超純水定容至10mL，配制KIO3和KI儲備液。分別取KIO3和KI儲備液混合，1%TMHA(測總碘時)或流動相(測無機碘時)定容至10mL，配制混合標準溶液，使KIO3和KI的碘濃度均為1000mg/L。用1%TMHA或流動相稀釋混合標準溶液，使得碘濃度為0、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100μg/L，分別用于總碘或無機碘的檢測。
1.2.4內標溶液配制取100μL銦標準品溶液，超純水定容至10mL，待上機檢測。
1.3ICP-MS檢測條件
1.3.1總碘ICP-MS測定樣品采用碰撞池氦氣模式，參數設置見表1，以銦(115In)作為內標，在線吸入內標溶液，測定樣品中的總碘含量，樣品之間以1%TMHA清洗系統。
1.3.2無機碘HPLC流動相為5.0mmol/LNaH2PO4、15.0mmol/LNa2SO4、5.0mmol/LEDTA-2Na(NaOH調至pH7.0)，流速1mL/min，色譜柱:鉻形態分析專用柱(30mm×4.6mm，Agilent)，進樣量10μL。ICP-MS測定樣品采用碰撞池氦氣模式，參數設置見表1，測定樣品中的無機碘含量。
2結果
2.1無機碘的色譜分離
色譜條件下，IO3-和I-在5.5min內即可實現基線分離，分離色譜圖見圖1。IO3-保留時間為37s，I-保留時間為326s，兩者峰型均良好，可通過峰面積積分進行定量分析。
2.2HPLC-ICP-MS檢測IO3-、I-的線性范圍和精密度
KIO3和KI的混合標準溶液在0.2～100μg/L濃度范圍內線性關系良好，相關系數(R2)為0.9998。
取空白溶液重復檢測10次計算相對標準偏差，3倍標準偏差為檢出限，10倍標準偏差為定量限。ICP-MS檢測I-的檢出限為0.17μg/L，定量限為0.58μg/L;IO3-的檢出限為0.16μg/L，定量限為0.55μg/L。取一個樣品分別進行多次測定計算相對標準偏差，評估方法的精密度，結果見表2，結果均滿足檢測要求。
2.3碘形態分析方法的準確性
由于IO3-在血清中不穩定，易被還原，所以在血清基質中只對I-進行加標回收實驗，驗證總碘檢測方法、無機碘形態檢測方法的準確性。
2.3.1總碘0.2mL血清加入不同量的I-后1%TMHA定容至10mL，使加入的I-終濃度分別為0.5、2.0、10.0μg/L，ICP-MS測定原血清稀釋樣本和加標樣本的I-含量，計算加標回收率。原血清稀釋樣品I-本底值為1.57μg/L，加標樣品I-的測定結果分別為2.01、3.62和11.64μg/L，加標回收率分別為96.2%、103.2%、104.5%。
2.3.2無機碘0.2mL血清加入不同量的I-后加入0.8mL甲醇，沉淀蛋白后取全部上清，流動相定容至1mL，使加入的I-終濃度分別為2.0、5.0、10.0μg/L，ICP-MS測定原血清樣本和加標樣本的I-含量，計算加標回收率。原血清稀釋樣品I-本底值為1.21μg/L，加標樣品I-的測定結果分別為3.15、5.90和11.07μg/L，加標回收率分別為96.8%、93.7%、98.6%。
2.4血清樣品碘形態分析結果
對實際血清樣品按照已建立的方法進行碘形態分析，結果見表3。檢測的5個血清樣本總碘含量為56.8～74.7μg/L、I-含量為2.6～12.2μg/L、基本不含IO3-(圖2)，計算得出有機碘含量45.3～66.0μg/L，占血清總碘含量的78.78%～91.02%。
3討論
人體內的碘主要來源于食物、空氣和水等，攝入的無機碘經單純擴散或主動轉運后快速被胃腸吸收，大部分有機碘則需要經過降解釋放出無機碘后，才可被吸收。機體根據自身需求，在甲狀腺中利用Na/I轉運系統從血液捕獲碘離子，經過氧化、碘化、偶聯、胞飲、酶解等過程，碘化物轉變為T3、T4等有機形態后擴散到血液并被運輸到組織器官中發揮生物功能。因此，只有被合成甲狀腺激素的碘即有機碘才能發揮其實際功效，而血液中游離碘化物的利用率取決于個體的碘供給狀況[10]，所以分別測定有機碘和無機碘的含量有助于評估個體的碘營養狀況。
本研究首先建立了血清碘的ICP-MS測定方法，I-和IO3-的檢出限均<0.2μg/L，顯著低于經典方法砷鈰催化分光光度法測定血清碘的檢出限(5.13μg/L)[11]，同時也低于陳美珠等[12]的ICPMS測定血清碘的檢出限(1.3μg/L)。ICP-MS檢測的高靈敏度是血清碘形態分析方法建立的基礎。
目前國內對于血清碘形態分析方法的研究較少，王媛等[13]建立了ICP-MS分析人血漿和尿液碘形態的方法，用陰離子色譜柱分離IO3-和I-，用尺寸排阻色譜柱分離有機碘和I-，檢出限0.3、0.6ng/mL，靈敏度與本研究結果較接近，但IO3-和I-的分離需要20min，且尺寸排阻色譜分離有機碘峰型較差，定量誤差較大。本研究中，采用常規ICP-MS法首先測定血清總碘，再利用鉻形態分析專用柱經HPLC-ICP-MS分離測定經甲醇沉淀蛋白后的血清樣品上清中的IO3-和I-，達到兩次進樣即可分析血清中有機碘、IO3-和I-的目的。樣品去除蛋白質后，可以避免蛋白質與色譜柱填料的相互作用，保護色譜柱不被污染，并且僅需5min左右即可分離IO3-和I-，簡潔快速實現血清碘形態分析。
利用建立的碘形態分析方法測定5個血清樣本的總碘含量為56.8～74.7μg/L，符合由世界衛生組織、奎斯特診斷公司以及美國梅奧醫學中心提供的電感耦合等離子體質譜法測定的正常成年人血清碘代謝指標的參考值范圍(分別是45～90μg/L、52～109μg/L和40～92μg/L)[14]。無機碘中I-含量2.6～12.2μg/L、基本不含IO3-，由總碘和無機碘計算得出有機碘含量為45.3～66.0μg/L。有機碘含量波動范圍較小，可能是USI政策實施后，中國居民碘營養狀況基本處于適宜水平，且在甲狀腺內有一定量的儲備，因此，血液中可發揮生理作用的有機碘含量基本穩定。而血液中無機碘與個體近期碘膳食攝入狀況相關性較高，因此波動范圍較大，碘形態分析方法的建立將有助于對個體碘營養狀況進行評估。
本研究建立了一種基于HPLC-ICP-MS的血清碘形態分析及定量檢測方法，尤其是無機碘的分析檢測方面提供了一種簡便的前處理方法，以甲醇沉淀血清中的蛋白質，去除與蛋白質結合的有機碘，上清經有效分離IO3-和I-后ICP-MS定量檢測。本方法適用于碘形態的快速檢測，也可為未來臨床、實驗室檢測人體碘營養狀況提供參考。——論文作者：于微1譚洪興1王俊1劉小兵2楊麗琛2劉小立1楊曉光2
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