發布時間：2021-09-28所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要合成了磁性富勒烯(Fe3O4@SiO2@C60)，考察了其作為固相萃取吸附劑對菊花中農藥的萃取富集性能，建立了超高效液相色譜-串聯質譜(UHPLC-MS/MS)同時測定可食用菊花中9種農藥(嘧菌環胺、苯酰菌胺、唑蟲酰胺、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯、唑螨酯、噠螨靈、辛
摘要合成了磁性富勒烯(Fe3O4@SiO2@C60)，考察了其作為固相萃取吸附劑對菊花中農藥的萃取富集性能，建立了超高效液相色譜-串聯質譜(UHPLC-MS/MS)同時測定可食用菊花中9種農藥(嘧菌環胺、苯酰菌胺、唑蟲酰胺、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯、唑螨酯、噠螨靈、辛硫磷)的分析方法。結果表明，Fe3O4@SiO2@C60對這9種農藥有明顯的吸附作用。考察了磁性分散固相萃取的影響因素，得到最佳的萃取和洗脫條件:以30.0mgFe3O4@SiO2@C60作為吸附劑，振蕩萃取20min，磁性分離，加1mL乙酸乙酯洗脫液解析并重復2次。制備的Fe3O4@SiO2@C60材料具有良好的穩定性和可重復利用性。在0.005～0.1mg/L范圍內，9種目標農藥呈現良好的線性關系，線性相關系數大于0.999。方法檢出限在0.001～0.003mg/kg之間，定量限在0.003～0.01mg/kg之間。當添加水平為0.01、0.05和0.10mg/kg時，回收率在71.0%～94.6%之間，相對標準偏差(n=6)在4.6%～11.3%之間。本方法操作簡單、靈敏度高、分析速度快、成本低，適用于菊花中上述9種農藥的定性與定量測定。
關鍵詞磁性富勒烯;分散固相萃取;液相色譜-串聯質譜;農藥殘留;菊花
菊花含有多種氨基酸、維生素、微量元素及菊花甙、膽堿、腺嘌呤等有效成分[1]，不僅具有觀賞價值，還具有藥用、飲用和食用等經濟價值，而其農藥殘留問題也逐漸引起關注[2-3]。目前，我國涉及菊花中農藥殘留的相關限量標準較少[4-5]，GB2763-2019《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》對鮮菊花及干菊花中吡蟲啉、井岡霉素制定了限量標準，為1～2mg/kg，這也是食品安全國家標準首次對代用茶制定農藥殘留限量[6]。2020版中國藥典對藥材及飲片中內吸磷等33種禁用農藥及其代謝物進行了規定[7]。相對于此，歐盟針對花卉中農藥殘留設定的最大殘留限量(MRL)則嚴格許多，共涉及農藥500余種，對MRL值未進行評估的農藥均實行0.01mg/kg的一律限量[8]。開發菊花中多種農藥殘留的高效、快速檢測技術，對可食用菊花農藥殘留水平風險監測、質量控制及進出口產品監管等均具有重要意義
菊花基質復雜，含有色素、有機酸等復雜化學成分，與殘留目標化合物的含量相差懸殊，其農藥殘留分析是一項對復雜混合物中痕量組分的分析技術。周紅英等[9]采用乙腈提取，經Carb/PSA雙層固相萃取柱凈化、氣相色譜結合FPD檢測器測定菊花中氧樂果、敵敵畏、甲基對硫磷、甲拌磷、內吸磷和對硫磷6種有機磷農藥殘留量，檢出限達到0.53～1.16μg/kg，回收率在78.5%～94.3%之間，相對標準偏差(RSD)為1.7%～5.9%。韓梅等[10]建立了一種加速溶劑萃取結合氣相色譜-串聯質譜法同時檢測菊花中123種農藥殘留的方法。樣品采用乙腈提取，經加速溶劑萃取，石墨化碳/氨基固相萃取小柱凈化，氣相色譜串聯質譜多反應監測模式測定，方法提取效率高、準確、靈敏。將傳統固相萃取方法應用于菊花中農藥的多殘留檢測分析，雖然凈化效果好，但目標物富集效率受樣品過柱速度影響較大，存在整體過柱耗時長、有機溶劑消耗大、時間長以及前處理步驟繁瑣等缺點，不利于大批量樣品的快速前處理。
碳基材料如富勒烯(C60)、碳納米管、石墨烯和介孔碳材料等，具有比表面積大、物理吸附性強、機械穩定性和熱穩定性高等優點。碳納米管、石墨烯等碳納米材料，對弱極性小分子農殘的分離富集具有極大優勢[11-12]。如石墨烯及其復合材料作為固相萃取和固相微萃取的吸附劑，具有芐基、萘基和嘧啶基的農藥易與石墨烯形成π-π堆積。Shi等[13]利用這一性質對含有該類官能團的6種氨基甲酸酯類農藥進行富集，經超高效液相色譜-串聯質譜進行檢測，回收率在81.1%～111.0%之間;Han等[14]以石墨烯為填料，制備固相萃取柱凈化蘋果汁中的有機磷，回收率為69.8%～106.2%。Deng等[15]制備了磁性多壁碳納米管(MWCNTs)，將其作為吸附劑結合氣質聯用儀建立了茶葉中異丙威、樂果、甲基對硫磷、馬拉硫磷、倍硫磷、硫丹、DDT和林丹的測定方法，回收率在72.50%～109.1%之間。張帆等[16]建立了MWCNTs為吸附劑的固相萃取凈化/超高效液相色譜-串聯質譜檢測茶油中12種氨基甲酸酯類農藥殘留的快速分析方法，樣品經乙腈超聲提取，MWCNTs固相萃取小柱凈化，農藥的平均回收率為78.3%～116.0%。相對而言，C60在農殘殘檢測方面的報道則較少。C60作為一種碳基納米材料，由于C原子采用sp2雜化，具有較強的親電能力，表現出缺電子多烯性質，并且π電子分布在C60三十二面體籠狀結構的內外表面，形成三維共軛體系，與芳香化合物有較強的π-π共扼作用[17]。C60在空氣中穩定，在多種有機溶劑中溶解度小，熱穩定性好。與碳納米管和石墨烯等碳納米材料類似，C60具有較大比表面積和很強的疏水性，易于進行功能化修飾，同時還具有很好的耐酸、耐堿、耐熱性能和化學穩定性，這些特點決定了富勒烯具有較好的選擇性和較大的吸附量，在農殘萃取領域具有良好的應用潛力。四氧化三鐵(Fe3O4)納米粒子具有超順磁性[18]，通過與碳納米材料構建磁性復合材料，將碳基納米材料的強吸附性能與Fe3O4納米粒子便捷的磁性分離能力相結合，建立磁分散固相萃取方法，可有效應用于農藥殘留[19-22]、抗生素殘留[23-24]和有機污染物殘留[25-27]等的富集凈化。由于磁性吸附劑材料分散在溶液中，使得樣品和磁性吸附劑之間的接觸面積更充足，質量轉移更快速，可快速達到平衡。整個萃取過程只需使用少量吸附劑和較短的平衡時間，即可實現萃取分離，省略了離心、過濾等前處理步驟，具有較高的萃取效率。另外，磁性碳納米材料具有化學惰性和抗化學腐蝕等優點，經適當處理，可多次循環使用。
本研究合成了磁性富勒烯(Fe3O4@SiO2@C60)，考察了其作為固相萃取吸附劑對菊花中多種農藥殘留的萃取富集性能。參考菊花中農藥殘留相關文獻報道[2-3]，本研究選取20種農藥，包括有機磷類、氨基甲酸酯類、新煙堿類、甲氧基丙烯酸酯類等類別，通過萃取富集效果對比及條件優化，結合超高效液相色譜三重四極桿串聯質譜技術，建立了食用菊花中多種農藥污染物磁固相萃取-液相色譜-質譜分析方法。針對樣品中不同類別農藥，采用加水浸泡、乙腈均質提取，再將提取液以水稀釋，以Fe3O4@SiO2@C60作為吸附劑萃取富集、磁性分離，采用乙酸乙酯洗脫，液相色譜-串聯質譜技術檢測。本方法操作簡單、靈敏度高、分析速度快，適用于菊花中嘧菌環胺、苯酰菌胺、唑蟲酰胺、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯、唑螨酯、噠螨靈和辛硫磷共9種農藥的定性與定量測定。
1實驗部分
1.1儀器與試劑
1290-6460超高壓液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀(美國Agilent公司);N-EVAP112氮吹濃縮儀(美國Organomation公司);Vortex-Genie2渦旋混勻器(美國ScientificIndustries公司);Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)。
富勒烯(蘇州大德碳納米科技有限公司);正硅酸四乙酯、三氯丙基三甲氧基硅烷(瑞士Adamas公司);甲醇、甲苯、乙腈、正己烷、丙酮(色譜純，美國TEDIA公司);FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、氨水、異丙醇、乙醇、三乙胺(分析純，國藥集團有限公司);內吸磷(Demeton-S)、氯唑磷(Isazophos)、硫線磷(Cadusafos)、辛硫磷(Phoxim)、克百威(Carbofuran)、殺線威(Oxamyl)、甲萘威(Carbaryl)、霜霉威(Propamocarb)、吡蟲啉(Imidacloprid)、啶蟲脒(Acetamiprid)、噻蟲啉(Thiacloprid)、呋蟲胺(Dinotefuran)、嘧菌環胺(Cyprodinil)、苯酰菌胺(Zoxamide)、唑蟲酰胺(Tolfenpyrad)、嘧菌酯Azoxystrobin)、吡唑醚菌酯(Pyraclostrobin)、肟菌酯(Trifloxystrobin)、唑螨酯(Fenpyroximate)和噠螨靈(Pyridaben)標準物質(純度≥98%，德國Dr.Ehrenstorfer公司);實驗所用水均為Milli-Q超純水儀制備的超純水(18.2MΩ·cm);0.22μm有機濾膜(上海安譜科學儀器有限公司)。
1.2實驗方法
1.2.1Fe3O4@SiO2@C60的制備
參考文獻[27]方法制備Fe3O4@SiO2@C60磁性材料，制備路線如圖1所示。首先取FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O，通過共沉淀法合成Fe3O4納米粒子，以正硅酸四乙酯包覆Fe3O4形成Fe3O4@SiO2，再以3-氯丙基三甲氧基硅烷修飾Fe3O4@SiO2，得到Fe3O4@SiO2@Cl納米粒子。將C60、苯甲醛和芐胺溶于鄰二氯苯中，反應后制得2，5-二苯基富勒烯吡咯啉，再與Fe3O4@SiO2@Cl納米粒子反應，最終得到Fe3O4@SiO2@C60納米粒子。
1.2.2標準溶液的配制
準確稱取上述標準品10mg(精確至0.01mg)，用乙腈溶解并定容至100mL棕色容量瓶中，于4℃避光保存。
1.2.3菊花樣品前處理
稱取2g(精確至0.01g)菊花樣品于50mL塑料離心管中，加入2mL水浸泡10min。加入18mL乙腈，于高速組織搗碎機上以15000r/min勻漿提取1min。以10000r/min離心5min，吸取1mL上清液于15mL尖底離心管中，加入9mL超純水，混勻，再加入30mgFe3O4@SiO2@C60磁性吸附劑，振蕩萃取20min。磁性分離，吸附劑加入1mL乙酸乙酯溶液，渦旋1min進行解吸，磁性分離后，將清液轉移到新的離心管中。重復解吸操作2次，合并所有解吸液，氮氣吹干，隨后用1mL初始流動相溶解，過0.22μm有機相濾膜，供UHPLC-MS/MS分析。
1.2.4儀器分析條件
液相色譜條件:安捷倫ZORBAXEclipsePlusC18柱(50mm×2.1mm，1.8μm);流動相A為0.05%(V/V)甲酸溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序:0～0.3min，5%B;0.3～2.5min，5%～40%B;2.5～6.5min，40%～80%B;6.5～8.5min，80%B;8.5～10min，5%B。流速:0.3mL/min;柱溫:40℃;進樣量10μL。
質譜條件:離子源:電噴霧電離源(ESI)，正離子模式，離子源溫度300℃，電噴霧電壓4000V，霧化氣壓力0.28MPa，干燥氣溫度300℃，干燥氣流速10L/min，毛細管電壓3000V。多反應監測模式(Multiplereactionmonitoring，MRM)，定性離子對、定量離子對、碎裂電壓(FP)及碰撞氣能量(CE)見表1。
2結果與討論
2.1磁性富勒烯的制備及表征
通過共沉淀法合成磁性Fe3O4納米粒子，再以正硅酸四乙酯包覆Fe3O4形成Fe3O4@SiO2，由于SiO2層的空間位阻作用，有利于顆粒分散，避免Fe3O4磁性顆粒團聚。以3-氯丙基三甲氧基硅烷修飾Fe3O4@SiO2得到Fe3O4@SiO2@Cl納米粒子，再與富勒烯衍生物2，5-二苯基富勒烯吡咯啉反應，制得Fe3O4@SiO2@C60納米粒子，保留Fe3O4的磁性效應，同時使外表面具備C60的吸附效應。通過透射電鏡(TEM)對材料進行形貌表征，結果見圖2。Fe3O4為準球形形狀，平均尺寸約20nm。Fe3O4@SiO2因包裹了一層硅膠，平均粒徑約100nm，Fe3O4@SiO2@C60因表面覆蓋了一層C60，比Fe3O4@SiO2尺寸略大。將合成的磁性Fe3O4@SiO2@C60均勻分散于水中，外加磁場后Fe3O4@SiO2@C60會迅速聚集，具有良好的磁響應能力。
2.2材料的農藥萃取性能測試
圖39種農藥的超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜分析譜圖Fig.3Ultra-highperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometric(UHPLC-MS/MS)analysisof9targetpesticides將20mgFe3O4@SiO2@C60磁性材料加入1mL濃度均為0.05mg/L的20種農藥混合標準溶液中30min，考察Fe3O4@SiO2@C60磁性材料對不同農藥的吸附性能，結果表明，Fe3O4@SiO2@C60對嘧菌環胺、苯酰菌胺、唑蟲酰胺、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯、唑螨酯、噠螨靈和辛硫磷吸附作用明顯，但對內吸磷、氯唑磷、硫線磷、克百威、殺線威、甲萘威、霜霉威、吡蟲啉、啶蟲脒、噻蟲啉和呋蟲胺吸附效果較差。通過對所選取的農藥結構進行分析，推測可能是由于嘧菌環胺、苯酰菌胺、唑蟲酰胺、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯、唑螨酯、噠螨靈和辛硫磷均具有苯環結構，有利于與Fe3O4@SiO2@C60中的富勒烯形成π-π共軛體系[28]，從而促進磁性材料對相應農藥的吸附。內吸磷、氯唑磷、硫線磷與辛硫磷均為有機磷類農藥，但前3種農藥結構中不含苯環結構，采用Fe3O4@SiO2@C60進行萃取富集時效果較差，也說明Fe3O4@SiO2@C60對農藥的富集效果主要基于π-π共軛效應。篩選嘧菌環胺、苯酰菌胺、唑蟲酰胺、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯、唑螨酯、噠螨靈和辛硫磷等9種農藥作為目標檢測物，進一步優化實驗條件。9種目標農藥的超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜色譜圖如圖3所示。
2.3磁性固相萃取條件的確定
2.3.1吸附動力學研究
萃取時間是影響萃取效率的重要因素。考察了不同萃取時間(5～35min)Fe3O4@SiO2@C60對嘧菌環胺、苯酰菌胺、唑蟲酰胺、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯、唑螨酯、噠螨靈和辛硫磷等9種農藥的萃取吸附效果。如圖4所示，隨著振蕩時間延長，各組分的萃取回收率增加，20min后，萃取回收率均趨于平衡，相對于傳統固相萃取方法，采用Fe3O4@SiO2@C60富集更高效、快速。
2.3.2吸附劑用量對吸附效果的影響
在空白樣品提取液中加入混合標準農藥標準溶液，固定每種農藥的濃度為0.1mg/L，考察了Fe3O4@SiO2@C60用量對9種農藥的萃取效果的影響。如圖5所示，當Fe3O4@SiO2@C60用量為30mg時，各組分的吸附率趨于平衡，回收率高于80%。因此，選擇Fe3O4@SiO2@C60的用量為30mg。
2.3.3樣品溶液離子強度的影響
由于離子強度可能會對目標化合物的吸附熱力學及吸附動力學產生影響，通過向樣品溶液中添加不同濃度的NaCl(0～25%，w/V)，探究了離子強度對目標農藥萃取效率的影響。結果表明，在考察的范圍內，離子強度對9種目標分析物的萃取效率基本無影響，因此后續實驗選擇不加鹽。
2.3.4洗脫劑的選擇
分別以乙腈、甲醇、丙酮和乙酸乙酯作為洗脫劑，考察各有機溶劑對9種目標農藥的洗脫效果。如圖6所示，乙腈和甲醇對大部分目標農藥的洗脫效果較差，而丙酮和乙酸乙酯對9種目標農藥的洗脫效果相對更強，其中，乙酸乙酯的洗脫效果最好。根據“相似相溶”原理，農藥組分洗脫效率與溶劑的極性相關，由Fe3O4@SiO2@C60萃取吸附的農藥極性相對較弱，而乙腈和甲醇為極性溶劑，洗脫效果較差。因此，選取乙酸乙酯作為洗脫劑。
2.4Fe3O4@SiO2@C60的重復使用性
對于磁性材料，可重復使用性是一個重要的指標。將萃取使用后的Fe3O4@SiO2@C60用丙酮清洗2次，然后用去離子水清洗2次，真空干燥后，再次重復以上吸附實驗。反復使用和再生10次后，Fe3O4@SiO2@C60對9種目標農藥的萃取效率依然大于85%。這說明Fe3O4@SiO2@C60材料具有良好的耐用性，至少可重復使用10次。
2.5方法學考察
配制了系列濃度的混合標準溶液(0.005～0.1mg/L)，在最優化條件下進行實驗和液相色譜-質譜檢測，以9種目標農藥的峰面積對質量濃度做工作曲線，9種農藥的線性相關系數均大于0.999。以3倍信噪比(S/N=3)確定檢出限(LOD)，以10倍信噪比(S/N=10)確定定量限(LOQ)，9種目標農藥的檢出限在0.001～0.003mg/kg之間，定量限在0.003～0.01mg/kg之間，能夠滿足歐盟最低限量(0.01mg/kg)的檢測需求。在不含9種目標農藥的菊花樣品中分別添加3個水平(0.01、0.05和0.10mg/kg)的樣品，每個水平重復6次，結果見表2，9種目標農藥的平均回收率在71.0%～94.6%之間，相對標準偏差(RSD)在4.6%～11.3%之間，準確度、精密度均符合食品理化檢測要求，表明本方法具有良好的靈敏度和重現性，能夠滿足定量分析的基本要求。——論文作者：宋偉*1，2周典兵1，2郭春麗1韓芳1，2丁磊1，2呂亞寧1，2賈學穎1鄭平1，2鄧曉軍3
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