發布時間：2021-09-28所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要目的：建立膚康凝膠的質量標準。方法：采用高效液相色譜法測定制劑中苦參堿、黃芩苷的含量。結果：苦參堿濃度線性范圍為18.56～296.96g/ml(R=0.9996)，黃芩苷濃度線性范圍為8.325～416.262g/ml(R=1)，精密度、穩定性、重復性試驗RSD均小于3.0%，加樣回收
摘要目的：建立膚康凝膠的質量標準。方法：采用高效液相色譜法測定制劑中苦參堿、黃芩苷的含量。結果：苦參堿濃度線性范圍為18.56～296.96μg/ml(R²=0.9996)，黃芩苷濃度線性范圍為8.325～416.262μg/ml(R²=1)，精密度、穩定性、重復性試驗RSD均小于3.0%，加樣回收率分別為97.09%～99.63%(RSD=1.016%，n=6)，92.04%～94.43%(RSD=1.111%，n=6)。結論：所建立的研究方法穩定、可靠、重復性好，可用于膚康凝膠的質量控制。
關鍵詞膚康凝膠苦參堿黃芩苷高效液相色譜法
膚康凝膠是院內制劑復方苦參洗劑通過劑型優化而成，該處方由我院皮膚科省級名中醫根據多年臨床經驗，在中醫古方“苦參湯”的基礎上研制而成，具有清熱解毒、燥濕止癢之功效，并經過長期臨床應用，在治療濕疹、皮膚膿皰疹及紅痱等瘙癢性、感染性皮膚病方面療效顯著，深受患者的歡迎，已成為皮膚科中醫治療的優勢藥物[1]。臨床上由于中藥洗劑存在用量大、攜帶使用不方便、病人依從性差等因素，故將其改造成具有生物相容性好,制備工藝簡單，局部給藥后易吸收、易清洗、使用舒適的外用凝膠，克服原劑型的缺陷，更好地發揮其顯著療效，提升我院新制劑的研制水平。為保證該制劑質量的穩定可控，安全有效，本文采用高效液相色譜法(HPLC)測定苦參堿及黃芩苷的含量，以建立膚康凝膠的質量標準。
1儀器與材料
1.1儀器與設備：高效液相色譜儀(日本島津LC-20AT型，SPD-20A型紫外可見檢測器);RE-200B旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);DHG9246A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司);DK-S24電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司);XS105DU分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司d=0.01mg);BT224S電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司d=0.1mg);BY-G16型高速醫用離心機(北京白洋醫療器械有限公司);OKO-PN電動噴霧器(武漢藥科新技術開發有限公司);YOKO-PX薄層顯色抽氣箱(武漢藥科新技術開發有限公司);ZF1-Ⅱ紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司);硅膠G薄層板(青島海洋化工廠)。
1.2藥品與試劑：苦參(產地：浙江)、黃芩(產地：山西)、黃連(產地：四川)均購于浙江中醫藥大學中藥飲片廠;苦參堿對照品(批號：110805-200508，含量100%);黃芩苷對照品(批號：110715-201619，含量93.5%)均購自中國藥品食品檢定研究院;膚康凝膠(批號：180520，180521，180522)，陰性樣品均由本實驗室自制;乙醇、無水乙醇、甲醇、磷酸、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷均為分析純;甲醇色譜純、乙腈色譜純(天津四友精細化學品有限公司)。
2方法與結果
2.1苦參堿的含量測定：分述如下。
2.1.1色譜條件[2-3]：色譜柱AgilentZORBAXNH2(4.6mm×150mm，5μm)，流動相乙腈-無水乙醇-3%磷酸溶液(82∶10∶8)，流速1.0ml/min;柱溫30℃，檢測波長220nm，進樣量為10μl。理論塔板數按苦參堿峰計算應不低于2000，分離度>1.5，各成分基線分離良好。
2.1.2線性范圍考察：精密稱取苦參堿對照品9.28mg至25ml的容量瓶中，加乙腈-無水乙醇(80∶20)混合溶液溶解并定容至25ml，制成對照品溶液母液。分別精密吸取0.5、1、2、4、8ml置10ml容量瓶中，加乙腈-無水乙醇(80∶20)稀釋至刻度，得一系列對照品溶液，濃度分別為18.56、37.12、74.24、148.48、296.96μg/ml，分別進樣10μl，峰面積分別為98800、213446、434292、848252、1770232。以進樣濃度x(μg/ml)為橫坐標、峰面積y為縱坐標繪制標準曲線，計算得回歸方程為y=5977.9x-14889(R²=0.9996)，表明苦參堿在18.56～296.96μg/ml范圍內線性關系良好。
2.1.3供試品溶液的制備：取本品1g至10ml量瓶中，加1ml氨水，加入適量三氯甲烷，超聲30min，放置過夜，過濾，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇定容至10ml，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液即得。
2.1.4陰性溶液的制備：按膚康凝膠處方和制備工藝制備缺苦參的陰性凝膠，按“2.1.3”項下方法制成陰性對照溶液。
2.1.5系統適應性試驗：取“2.1.2”“2.1.3”“2.1.4”項下對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液，按“2.2.1”色譜條件注入高效液相色譜儀測定，記錄色譜圖，理論塔板數按苦參堿峰計算應不低于2000，分離度>1.5，各成分基線分離良好。苦參堿對照品溶液在12.5min左右有峰，供試品在相應時間均有峰與之對應，而陰性對照溶液在12.5min左右無峰，表明其他成分對苦參堿的測定無干擾。結果見圖1。
2.1.6精密度考察：精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液，在“2.1.1”色譜條件下，連續進樣6次，每次10μl，測定苦參堿的峰面積，結果，苦參堿峰面積的RSD=0.827%(n=6)。表明儀器精密度良好。
2.1.7穩定性試驗：取“2.1.3”項下供試品溶液，在“2.1.1”色譜條件下于0、2、4、8、12h分別進樣，進樣量為10μl，測定苦參堿的峰面積，結果苦參堿峰面積的RSD=1.081%(n=6)。表明供試品溶液在12h內基本穩定。
2.1.8重復性試驗：取同一批次樣品6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”色譜條件測定峰面積，記錄峰面積并計算含量。結果苦參堿的RSD=1.193%(n=6)。表明本方法重復性良好。
2.1.9加樣回收率試驗：精密稱取6份已知含量的凝膠1g，分別精密加入“2.1.2”項下苦參堿296.96μg/ml對照品溶液1ml，按“2.1.3”制備。在“2.1.1”色譜條件下測定其峰面積。加樣回收率(%)=[(測得量-樣品量)/標準量]×100%。測得平均回收率98.80%，RSD值為1.016%。說明本方法回收率較好。結果見表1。
2.1.10樣品含量測定：取3批樣品各適量，分別按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定并計算含量，結果三批樣品中苦參堿含量分別為255.712μg/g、259.086μg/g、258.106μg/g。
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2.2黃芩苷的含量測定[4]：分述如下。
2.2.1色譜條件：色譜柱AgilentEclipsePlusC18(4.6mm×250mm，5μm)，流動相乙腈-0.1%磷酸溶液(23∶77)，流速1.0ml/min;柱溫30℃，檢測波長280nm，進樣量為10μl。
2.2.2線性范圍考察：精密稱取黃芩苷對照品11.13mg，加甲醇溶解并定容至25ml，制成對照品溶液母液。分別精密吸取0.5、1、2、4、8ml置25ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得一系列對照品溶液，濃度分別為8.325、16.650、33.301、66.602、133.204、416.262μg/ml，分別進樣10μl，峰面積分別為318001、628671、1284462、2529878、5188639、16337665，以進樣濃度x(μg/ml)為橫坐標、峰面積y為縱坐標繪制標準曲線，計算得回歸方程為y=39315x-37471(R²=1)，表明黃芩苷在8.325～416.262μg/ml范圍內線性關系良好。
2.2.3供試品溶液的制備：取本品0.25g至50ml量瓶中，加入適量甲醇，60℃水浴保溫15min，再超聲30min，冷卻后加甲醇定容至50ml，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液即得。
2.2.4陰性溶液的制備：按膚康凝膠處方和制備工藝制備缺黃芩的陰性凝膠，按“2.2.3”項下方法制成陰性對照溶液。
2.2.5系統適應性試驗：取“2.2.2”“2.2.3”“2.2.4”項下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各適量，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，理論塔板數按黃芩苷峰計算應不低于2500，分離度>1.5，各成分基線分離良好。供試品溶液的色譜圖在與黃芩苷對照品相應保留時間處有色譜峰與之對應，而缺黃芩的陰性對照溶液在15min左右沒有色譜峰，表明陰性對照對黃芩苷的測定無干擾。見圖2。
2.2.6精密度試驗：精密吸取“2.2.2”項下對照品溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件，連續進樣6次，每次10μl，測定黃芩苷記錄峰面積，結果，黃芩苷峰面積的RSD=0.069%(n=6)，表明儀器精密度良好。
2.2.7穩定性試驗：取“2.2.3”項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、16h時按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，黃芩苷峰面積的RSD=0.341%(n=6)，表明供試品溶液在室溫放置16h內基本穩定。
2.2.8重復性試驗：精密稱取同一批樣品適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果黃芩苷的RSD=2.549%，表明本方法重復性良好。
2.2.9加樣回收率試驗：精密稱取黃芩苷對照品17.91mg，加甲醇溶解并定容至25ml，制成對照品溶液，再精密稱取6份已知含量的膚康凝膠0.25g，分別精密加入對照品溶液3ml，按“2.2.3”制備。在“2.2.1”色譜條件下測定其峰面積計算加樣回收率。加樣回收率(%)=[(測得量-樣品量)/標準量]×100%。測得平均回收率92.88%，RSD值為1.111%。說明本方法回收率較好。結果見表2。
2.2.10樣品含量測定：取3批樣品各適量，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定并計算含量，結果三批樣品中黃芩苷含量分別為7.504mg/g、7.661mg/g、7.528mg/g。
3討論
膚康凝膠方中苦參為主藥，具有清熱燥濕、祛風殺蟲的作用，治療滲出、瘙癢、紅腫皮膚病;黃芩清熱燥濕、消腫止血;黃連味苦、性寒，清熱燥濕、瀉火解毒，兩者皆為臣藥，屬于清熱燥濕配伍的經典對藥。其作為院內制劑應用于臨床20余年，在皮膚病方面療效顯著。苦參堿是苦參中主要有效成分，具有廣泛的生物活性，具有抗菌、抗病毒、抗炎等藥理功效[5]，苦參又為方中君藥，與該制劑的功能主治相符，黃芩苷為黃芩的主要活性成分之一[6]，也具有顯著的抗菌、抗炎、抗病毒作用，由于復方制劑成分復雜，充分考慮到本方其藥效物質基礎為多成分共同作用，因此，本試驗對苦參和黃芩進行了定量考察。
本次實驗考察苦參堿含量時查閱了大量文獻和參考藥典供試品處理方法，比較了乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷超聲萃取的方法，萃取效果較為理想的是三氯甲烷。流動相分別考察了乙腈-無水乙醇-3%磷酸(80∶10∶10，81∶10∶9，82∶10∶8，V/V)，最終確定(82∶10∶8)的流動相分離度最佳，峰形好，出峰時間合適;在測定黃芩苷的含量時，分別采用了乙腈-0.1%磷酸溶液(25∶75，24∶76，23∶77，22∶78，V/V)等不同配比流動相進行試驗，由于中藥成分較多且復雜，每針進樣時間考察40min。結果發現，流動相配比為乙腈-0.1%磷酸溶液(25∶75，24∶76，V/V)時，黃芩苷的分離度均<1.5，當乙腈-0.1%磷酸溶液(23∶77，V/V)時分離度為2.2，峰形較好，分離度、峰面積均合適，保留時間約15min，在35min中左右時，樣品仍有出峰。而乙腈-0.1%磷酸溶液(22∶78，V/V)分離度高達21，保留時間約21min，相應進樣時間40mim后，還有樣品峰出現，進樣時間大大增加。最終選擇流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液(23∶77，V/V)。
綜上所述，本試驗中苦參堿和黃芩苷的含量測定，方法特征性強，無陰性干擾，分離度、重復性、穩定性、加樣回收率均符合要求，且所測3批樣品含量穩定，說明該方法可行，可作為該制劑的含量測定方法。結果表明所建立的定量方法能較好地控制膚康凝膠質量，提高了藥品質量的可控性。——論文作者：甘燦云陳海紅楊海燕
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