發布時間：2021-09-27所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：采用高效液相色譜法同時測定小葉丁香中4種具有保肝護肝作用的活性成分，為小葉丁香作為畜禽飼料開發利用提供依據。將干燥的小葉丁香莖葉部位粉碎，用950mL/L乙醇超聲提取，濃縮，甲醇溶解，離心取上清液經微孔濾膜過濾，以乙腈-1mL/L醋酸水溶液為流動
摘要：采用高效液相色譜法同時測定小葉丁香中4種具有保肝護肝作用的活性成分，為小葉丁香作為畜禽飼料開發利用提供依據。將干燥的小葉丁香莖葉部位粉碎，用950mL/L乙醇超聲提取，濃縮，甲醇溶解，離心取上清液經微孔濾膜過濾，以乙腈-1mL/L醋酸水溶液為流動相，進行梯度洗脫，在254nm和330nm雙波長下測定，分析小葉丁香中橄欖苦苷、紫丁香苷、松果菊苷和連翹酯苷B的含量。數據顯示，松果菊苷在5μg/mL～80μg/mL，橄欖苦苷在50μg/mL～800μg/mL，紫丁香苷和連翹酯苷B在50μg/mL～1000μg/mL濃度范圍內線性關系良好，平均加樣回收率為95.2%～99.4%，相對標準偏差介于1.73%～2.83%。該方法前處理簡單，靈敏，重復性良好。經測定，小葉丁香莖葉中橄欖苦苷、紫丁香苷、松果菊苷和連翹酯苷B的平均含量分別為0.709%、0.452%、0.059%和0.512%。
關鍵詞：小葉丁香;高效液相色譜;護肝;活性成分
肝臟是動物體內重要的解毒和代謝器官。由于抗生素等藥物濫用，飼料霉變，細菌、病毒或寄生蟲侵染以及環境污染等影響，畜禽在大規模養殖過程中極易造成肝臟損傷，引發肝臟疾病。這極大影響了畜禽養殖的生產性能和經濟效益，亟需科技工作者研究解決。
近年來，發酵中藥或中草藥添加劑已在畜牧養殖中廣泛應用，具有低耐藥性、低藥物殘留，對動物、人類和自然環境不良影響較小等優勢[1-2]。小葉丁香(SyringamicrophyllaDiels，SMD)為木樨科丁香屬植物，又名四季丁香、二度梅和野丁香等，主要分布于我國河南、河北、陜西等地[3]，在我國北方作為觀賞性園林植物廣泛應用，民間用其花、果實等泡茶飲用，具有消炎、鎮咳、治療肝炎和肝硬化之療效。小葉丁香富含糖苷類活性化合物，主要有以紫丁香苷、松果菊苷和連翹酯苷B等為主的苯乙醇苷類，以橄欖苦苷為主的裂環環烯醚萜苷類和黃酮苷類等[4-7]。現代藥理研究表明，橄欖苦苷和紫丁香苷具有較好的肝細胞保護作用[8]。橄欖苦苷對脂多糖和四氯化碳誘導的小鼠肝損傷均有顯著的保護作用，其作用機制可能與阻止肝臟炎性反應有關[9-10]。紫丁香苷則是一種強抗肝毒藥物，可通過恢復微粒體酶系統的酶活性和抑制脂質過氧化作用促進肝毒物代謝并改善肝功能。松果菊苷可提高肝損傷小鼠的存活率、降低ALT水平和改善肝組織學形態，并可明顯降低大鼠血清中ALT、AST、MDA和ROS產物，提高SOD活性和GSH含量，具有良好的抗炎和肝損傷保護作用[11-12]。連翹酯苷可通過減輕肉雞氧化應激，抑制肝組織脂質過氧化反應，有效提高其肝臟抗損傷能力[13]。因此，小葉丁香枝葉富含保肝護肝活性成分，可通過發酵、復配加工等開發功能型畜禽飼料或飼料添加劑，具有良好的市場應用前景。
目前，尚未見報道關于同時測定小葉丁香中保肝護肝活性成分的檢測方法。本研究采用高效液相法同時測定了小葉丁香中4種護肝活性成分，可為小葉丁香枝葉的綜合開發利用和質量控制奠定基礎。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1植株小葉丁香，購自中國(亳州)中藥材交易中心，經陜西科技大學食品與生物工程學院藥學系生藥學講師楊文娟鑒定，所購植株為Syringami-crophyllaDiels。
1.1.2試劑4種標準品橄欖苦苷(含量98.50%，批號AF20051703)、紫丁香苷(含量99.47%，批號AF9093171)、連翹酯苷B(含量98.53%，批號AF2052702)、松果菊苷(含量98.82%，批號AF20051710)，成都埃法生物科技有限公司產品;乙腈、甲醇，色譜純，FisherScientific公司產品;其他試劑均為分析純。
1.1.3儀器高效液相色譜儀(LC-16)，島津中國公司產品;超純水制備系統(MilliporeMillivPlus)，美國Millipore公司產品;電子天平(LE204E/02)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產品;電子天平(JA2603B)，上海天美天平儀器有限公司產品;超聲波清洗器(YM-1005)，深圳市方奧微電子有限公司產品。
1.2方法
1.2.1色譜條件色譜柱AkzoNobelKromasiLC18(4.6mm×250mm，5μm);流動相為乙腈(A)和1mL/L醋酸水溶液(B)梯度洗脫，洗脫程序為0～15min，5%～15%B、15min～20min，15%～20%B、20min～30min，20%～25%B、30min～60min，25%～40%B;流速為1.0mL/min;柱溫30℃;進樣量10μL;檢測器為紫外檢測器，采用254nm和330nm雙波長檢測。
1.2.2溶液的制備
1.2.2.1儲備液的制備分別稱取4種標準品適量，甲醇溶解并定容，配制成單一標準品儲備液，置-4℃保存。其中，紫丁香苷和連翹酯苷B儲備液濃度為1000μg/mL，橄欖苦苷儲備液濃度為800μg/mL，松果菊苷儲備液濃度為80μg/mL。
1.2.2.2標準品溶液的制備用甲醇將上述儲備液分別稀釋成標準品梯度溶液，置-4℃保存。其中，松果菊苷標準品梯度溶液的濃度分別為5、10、20、40、80μg/mL;橄欖苦苷標準品梯度溶液的濃度分別為50、100、200、400、800μg/mL;紫丁香苷和連翹酯苷B標準品梯度溶液的濃度分別為50、100、250、500、1000μg/mL。
1.2.2.3供試品溶液的制備取小葉丁香的莖葉，80℃干燥，粉碎。準確稱取7.50g至200mL三角瓶，以10倍量950mL/L乙醇超聲提取30min，提取2次，合并濾液，蒸干，加適量甲醇溶解，離心，上清液移至100mL容量瓶，甲醇定容，即得供試品溶液。測定前，用0.22μm微孔濾膜過濾。
1.2.3線性考察將“1.2.2.2”中4種活性成分的標準品梯度溶液，在“1.2.1”中規定的色譜條件下進行分析，記錄色譜峰峰面積。以進樣濃度(μg/mL)為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算標準曲線的回歸方程和相關系數。
1.2.4精密度試驗按“1.2.2.3”中方法制備供試品溶液，將同一樣品連續進樣6次，每次10μL，測定色譜峰峰面積，分別計算4種活性成分對應峰面積的相對標準偏差(RSD)，考察測定方法的精密度。
1.2.5穩定性試驗取同一供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24h，每次進樣10μL，測定色譜峰峰面積，分別計算4種活性成分對應峰面積的相對標準偏差(RSD)，考察測定方法的穩定性。
1.2.6重復性試驗按“1.2.2.3”中方法制備6份供試品溶液，每次進樣10μL，測定色譜峰峰面積，分別計算4種活性成分對應峰面積的相對標準偏差(RSD)，考察測定方法的重復性。
1.2.7加樣回收率試驗精密移取已知含量的小葉丁香供試品溶液，分別加入4種不同活性成分的對照品溶液，配制成加樣樣品溶液，每種活性成分配制6份，進樣量為10μL，測定色譜峰峰面積，分別計算4種活性成分對應的加樣回收率和相對標準偏差(RSD)。
1.2.8小葉丁香樣品測定將不同批號的小葉丁香樣品6份，分別制備成供試品溶液，每個供試品溶液測定2次，每次進樣10μL，計算不同批號小葉丁香樣品中橄欖苦苷、紫丁香苷、松果菊苷和連翹酯苷B的平均含量。
1.2.9數據處理試驗數據使用SPSS軟件(19.0版)進行統計處理，數據表示為平均值±標準差。
2結果
2.1線性關系以進樣濃度(μg/mL)為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，以最小二乘法做線性回歸，標準曲線的回歸方程和線性關系見表1。松果菊苷在5μg/mL～80μg/mL、橄欖苦苷在50μg/mL～800μg/mL、紫丁香苷和連翹酯苷B在50μg/mL～1000μg/mL濃度范圍內，相關系數r為0.9998～0.9999，說明4種活性成分的峰面積與質量濃度的線性關系良好。
相關期刊推薦：《動物醫學進展》(月刊)原名為《國外獸醫學—畜禽疾病》，1980年創刊，主要報道國內外動物醫學方面先進的理論與技術，基礎與臨床兼顧，讀者對象為全國農業、醫學院校師生，科研人員，畜牧獸醫人員，包括動物檢疫、獸醫衛生防疫、動物衛生監督、動物疫病預防控制、畜禽產品檢驗與監督、獸藥監督管理人員，畜禽疾病、寵物疾病、水生動物疾病、野生動物疾病防治人員，實驗動物、比較醫學等方面的科研人員，以及畜牧獸醫行政管理人員。
4種活性成分標準品和供試樣品測定的HPLC色譜圖見圖1，其主峰分離度均較好。
2.2精密度試驗4種活性成分分別連續進樣6次，理論塔板數均大于2500，保留時間和峰面積RSD見表2。橄欖苦苷、紫丁香苷、松果菊苷和連翹酯苷B在色譜系統中保留時間均較穩定，RSD介于0.12%～0.22%，且所測得峰面積的RSD分別為2.01%、2.36%、2.09%和2.77%，表明該方法的儀器精密度良好。
2.3穩定性試驗
4種活性成分供試品溶液制備后在室溫放置24h，分別在規定時間測定主峰峰面積，其相對標準偏差RSD見表3。在24h內，橄欖苦苷、紫丁香苷、松果菊苷和連翹酯苷B在色譜系統中保留時間均較穩定，RSD介于0.07%～0.15%，且所測得的峰面積也都未發生明顯變化，相對標準偏差依次為1.67%、2.20%、1.88%和1.97%，表明該方法穩定性良好。
2.4重復性試驗
4種活性成分對應峰面積的相對標準偏差(RSD)見表4。橄欖苦苷、紫丁香苷、松果菊苷和連翹酯苷B在色譜系統中保留時間較穩定，RSD介于0.11%～0.95%，且所測得峰面積RSD分別為2.21%、2.37%、2.51%和2.92%，表明該方法重復性良好。
2.5加樣回收率試驗
4種活性成分對應的平均加樣回收率和相對標準偏差RSD見表5。4種活性成分的加樣回收率都介于95%～105%，符合藥典要求。橄欖苦苷、紫丁香苷、松果菊苷和連翹酯苷B的平均加樣回收率分別為99.08%、95.20%、99.40%和98.69%，RSD值分別為1.73%、2.55%、2.83%和1.89%，表明該方法準確度良好。
2.6小葉丁香樣品測定
經測定，不同批號小葉丁香樣品中橄欖苦苷、紫丁香苷、松果菊苷和連翹酯苷B的含量分別為0.709%±0.016%、0.452%±0.012%、0.059%±0.003%和0.512%±0.012%。
3討論
本研究選用紫外檢測器，其線性范圍廣，受影響的范圍較小，可滿足多組分同時測定的要求。根據《中華人民共和國藥典第一部(2020年版)》規定[14]，紫丁香苷檢測波長為265nm，松果菊苷檢測波長為330nm。另有資料顯示[15-16]，橄欖苦苷檢測波長為285nm，連翹酯苷B檢測波長為332nm。為兼顧方法的靈敏性和可操作性，本方法采用雙波長檢測，橄欖苦苷和紫丁香苷的檢測波長確定為254nm，松果菊苷和連翹酯苷B的檢測波長確定為330nm。
試驗分別考察了甲醇-水、甲醇-1mL/L醋酸水溶液、甲醇-1mg/mL磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-1mL/L醋酸水溶液、乙腈-1mg/mL磷酸水等洗脫體系。結果發現，含甲醇流動相體系的分離度均不能全部滿足要求，含乙腈流動相體系的分離度可以滿足要求，且峰型較好。經優化，采用乙腈(A)-1mg/L醋酸水溶液(B)流動相體系梯度洗脫進行檢測，梯度洗脫程序確定為0～15min，5%～15%B、15min～20min，15%～20%B、20min～30min，20%～25%B、30min～60min，25%～40%B。
試驗比較了甲醇、乙醇和乙腈等溶劑對4種活性成分的提取率，并對超聲、索氏、回流和滲漏等不同提取方法及其提取條件進行考察。結果表明，以10倍量950mL/L乙醇超聲提取30min，提取2次的效果最好，提取率大于其他方法，且樣品處理時間短、操作簡單。
中國藥典第一部(2020年)在暴馬子皮和肉蓯蓉2種藥材或飲片的含量測定中規定了紫丁香苷和松果菊苷的檢測方法，有關學者也分別研究了小葉丁香中橄欖苦苷和抗宮炎軟膠囊中連翹酯苷B的HPLC測定方法。但是，這4種活性成分測定時，其供試品溶液制備方法，HPLC測定的流動相組成、洗脫程序及檢測波長均不一致，無法直接參照用于同時測定小葉丁香中多組分的含量。本研究通過優化樣品處理方法和HPLC色譜條件，建立了同時測定小葉丁香中4種護肝活性成分含量的方法，為評價小葉丁香的產品質量和護肝功效提供了理論依據。試驗對采自不同地區的6份小葉丁香樣品進行了檢測，其莖葉富含護肝活性成分，橄欖苦苷、紫丁香苷、松果菊苷和連翹酯苷B的平均含量分別為0.709%、0.452%、0.059%和0.512%。這表明小葉丁香可開發成具有養肝護肝功效的飼料或飼料添加劑，用于畜禽規模養殖。——論文作者：施春陽1，2，馬養民3，劉玉枝1，梁承遠1，李道明1
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