發布時間：2021-09-27所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：目的：建立參柏濕疹搽劑中苦參堿和氧化苦參堿、黃柏堿和小檗堿的含量測定方法。方法：采用高效液相色譜(HPLC)法測定搽劑中苦參堿和氧化苦參堿、黃柏堿和小檗堿含量。結果：苦參堿、氧化苦參堿、黃柏堿、小檗堿分別在(17.2～176g/mL，R2=0.9995)、(4.8
摘要：目的：建立參柏濕疹搽劑中苦參堿和氧化苦參堿、黃柏堿和小檗堿的含量測定方法。方法：采用高效液相色譜(HPLC)法測定搽劑中苦參堿和氧化苦參堿、黃柏堿和小檗堿含量。結果：苦參堿、氧化苦參堿、黃柏堿、小檗堿分別在(17.2～176μg/mL，R2=0.9995)、(4.8～48μg/mL，R2=0.9999)、(4.8～30μg/mL，R2=0.9999)、(20.8～130μg/mL，R2=0.9995)與峰面積呈良好的線性關系，平均加樣回收率為105.36%(RSD=2.68%)、92.37%(RSD=2.89%)、98.52%(RSD=2.67%)、95.6%(RSD=2.96%)。結論：此方法靈敏度和準確度高，專屬性強，可用于參柏濕疹搽劑的質量控制。
關鍵詞：參柏濕疹搽劑;苦參堿;氧化苦參堿;黃柏堿;鹽酸小檗堿;HPLC法
參柏濕疹搽劑是柳州市婦幼保健院皮膚科用于治療皮膚濕疹的經驗方(以兒童患者為主)，由苦參、黃柏、地榆、紫草、馬齒莧、雷公藤、丹參七味中藥組成，組合新穎，療效明確可靠，具有清熱燥濕止癢、涼血活血透疹的功效[1]。本研究擬通過制定方中苦參堿和氧化苦參堿、黃柏堿和小檗堿的高效液相含量測定法，來達到控制藥物質量的目的。
1材料
1.1儀器
高效液相色譜儀(島津香港有限公司);電子分析天秤(型號FA1004，上海天平儀器廠);數顯恒溫水浴鍋(型號HH-6，江蘇金壇市環宇科學儀器廠);數控超聲波清洗器(型號KQ-300DB，昆山市超聲儀器有限公司)。
1.2試劑
對照品均為南京源植生物科技有限公司生產：黃柏堿對照品(批號yz180414)、小檗堿對照品(批號yz180103)、苦參堿對照品(批號yz170331)、氧化苦參堿對照品(批號yz170614);參柏濕疹搽劑樣品(每瓶500ml)由柳州市婦幼保健院藥劑科制劑室提供(批號：20200423，20200522，20200624);乙腈(天津市科密歐化學試劑有限公司20200221)、甲醇(天津市四友精細化學品有限公司633379)為色譜純;其他試劑均為分析純，水為純化水。
2方法與結果
2.1苦參堿和氧化苦參堿含量測定
2.1.1溶液的制備①供試品溶液：精密量取濕疹方樣品5mL，置于分液漏斗中，加入濃氨試液1mL，充分振搖后，靜置30min，用30mL氯仿分3次萃取，每次10mL，收集氯仿層，置于蒸發皿中，水浴蒸干，殘渣用0.1%磷酸水溶液溶解定容至25mL，微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。②陰性對照：按參柏濕疹搽劑處方工藝制備缺苦參的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成缺苦參的陰性對照溶液。③混合對照品溶液：精密稱取苦參堿對照品和氧化苦參堿適量，用0.1%磷酸水超聲溶解，定容，得到70.4μg/mL苦參堿，19.2μg/mL氧化苦參堿混合對照溶液[2-7]。
2.1.2色譜條件DiamonsilC18(2)(250mm×4.6mm，5μm)，流動相為乙腈-甲醇-0.1%磷酸=3∶4∶93，流速1.0mL/min，柱溫30℃，波長220nm，進樣量20μL。
2.1.3專屬性試驗分別取混合對照品溶液，供試品溶液和陰性對照溶液20μL按照上述色譜條件進行測定，記錄色譜(見圖1)。結果表明，供試品溶液中苦參堿和氧化苦參堿色譜峰于相鄰色譜峰有效分離，分離度均大于1.5，陰性對照表明無其他雜質干擾。
2.1.4線性關系精密稱取苦參堿對照品4.4mg，氧化苦參堿對照品1.2mg，加適量0.1%磷酸溶液超聲溶解，定容至25mL。分別取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，用0.1%磷酸溶液定容至5mL，得到苦參堿17.6、35.2、70.4、105.6、140.8、176μg/mL和氧化苦參堿4.8、9.6、19.2、28.8、38.4、48μg/mL的混合對照溶液。以0.45μm的微孔濾膜過濾后按“2.1.2”色譜條件進樣，記錄峰面積，以峰面積為Y軸，對照品濃度為X軸，繪制標準曲線，進行線性回歸，得到苦參堿回歸方程為y=11608x+38703(R2=0.9995)，氧化苦參堿回歸方程為y=12758x+22513(R2=0.9999)，結果表明，苦參堿在17.6～176μg/mL質量濃度范圍內，氧化苦參堿在4.8～48μg/mL質量濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系。
2.1.5精密度精密吸取制備好的同一供試品溶液20μL，按“2.1.2”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果顯示，苦參堿、氧化苦參堿峰面積的RSD分別為0.943%、0.465%(n=6)，表明該色譜條件下方法精密度良好。
2.1.6穩定性精密吸取制備好的同一供試品溶液20μL，按“2.1.2”項下色譜條件，分別在制備樣品后0、2、4、6、8、10、24h進樣，記錄峰面積。結果顯示，苦參堿、氧化苦參堿峰面積的RSD分別為1.23%、1.52%(n=6)，均>3%，表明供試品溶液在24h內穩定。
2.1.7重復性取同一批次參柏濕疹搽劑，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，平行6份，按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，苦參堿、氧化苦參堿的平均含量分別為226.19、33.78μg/mL，RSD分別為1.41%、1.75%(n=6)，均<3%，表明該方法重復性較好。
2.1.8加樣回收率取已知含量的同一批次參柏濕疹搽劑2.5mL，混合對照2.5mL(其中苦參堿∶樣品含量=0.5∶1，氧化苦參堿∶樣品含量=1∶1)，再按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率。結果顯示，苦參堿和氧化苦參堿的平均加樣回收率分別為105.36%、92.37%，RSD分別為2.68%、2.89%(n=6)，表明該方法準確度較好，結果見表1。
2.1.9樣品含量測定取3個批次(批號20200423、20200522、20200624)參柏濕疹搽劑樣品各一瓶，按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液各3份，供試品溶液及混合對照品溶液各20μL，按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品中苦參堿和氧化苦參堿的含量。結果顯示，3個批次樣品中苦參堿、氧化苦參堿的平均含量分別為208.44μg/mL、41.04μg/mL，平均總含量為249.48μg/mL。根據3批樣品含量測定結果可知，制劑中苦參堿和氧化苦參堿總量的平均值為124.72mg/瓶，按平均含量的80%設限，初步擬定以苦參堿、氧化苦參堿總量計，每瓶制劑中不得少于99mg。樣品中苦參堿、氧化苦參堿含量測定結果見表2。
2.2黃柏堿和小檗堿含量測定
2.2.1溶液的制備①供試品溶液：取樣品2.5mL，加1%鹽酸甲醇定容至5mL，離心，取上清液微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。②陰性對照：按參柏濕疹搽劑處方工藝制備缺黃柏的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成缺黃柏的陰性對照溶液。③混合對照品溶液：精密稱取黃柏堿對照品和小檗堿適量，用50%(1%鹽酸)甲醇水溶解，定容，得到15μg/mL黃柏堿，65μg/mL小檗堿混合對照溶液[8-12]。
2.2.2色譜條件DiamonsilC18(2)(250mm×4.6mm，5μm)，流動相為乙腈(A)-0.2%磷酸(每100mL含十二烷基磺酸鈉0.1g)(B)，梯度洗脫(見表3)，流速1.0mL/min，柱溫30℃，波長284nm，進樣量20μL。
2.2.3專屬性試驗分別取混合對照品溶液，供試品溶液和陰性對照溶液20μL按照上述色譜條件進行測定，記錄色譜(見圖2)。結果表明，供試品溶液中黃柏堿和小檗堿色譜峰與相鄰色譜峰有效分離，分離度均大于1.5，陰性對照表明無其他雜質干擾。
2.2.4線性關系考察精密稱取黃柏堿對照品2.4mg，50%(1%鹽酸)甲醇水定容至10mL，得0.24mg/mL黃柏堿溶液。精密量取2.5mL黃柏堿溶液置于10mL容量瓶中，再加入精密稱定的小檗堿對照品2.6mg，用50%(1%鹽酸)甲醇水定容至刻度，搖勻。分別取0.4、0.8、1.25、2.1、2.5mL，用50%(1%鹽酸)甲醇水溶液定容至5mL，得到黃柏堿4.8、9.6、15、20.4、25.2、30μg/mL和小檗堿20.8、41.6、65、109.2、130μg/mL的混合對照溶液。以0.45μm的微孔濾膜過濾后按2.2.2色譜條件進樣，記錄峰面積，以峰面積為Y軸，對照品濃度為X軸，繪制標準曲線，進行線性回歸，得到黃柏堿回歸方程為y=28545x+12888(R2=0.9999)，小檗堿回歸方程為y=51.187x+98.34(R2=0.9995)，結果表明，黃柏堿在4.8～30μg/mL質量濃度范圍內，小檗堿在20.8～130μg/mL質量濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系。
2.2.5精密度精密吸取制備好的同一供試品溶液20μL，按“2.2.2”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果顯示，黃柏堿、小檗堿峰面積的RSD分別為0.874%、1.643%(n=6)，表明該色譜條件下方法精密度良好。
2.2.6穩定性精密吸取制備好的同一供試品溶液20μL，按“2.2.2”項下色譜條件，分別在制備樣品后0、2、4、6、8、10、24h進樣，記錄峰面積。結果顯示，黃柏堿、小檗堿峰面積的RSD分別為1.15%、1.90%(n=6)，均<3%，表明供試品溶液在24h內穩定。
2.2.7重復性取同一批次參柏濕疹搽劑，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，平行6份，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，黃柏堿、小檗堿的平均含量分別為24.5、84.5μg/mL，RSD分別為1.46%、2.16%(n=6)，均<3%，表明該方法具有良好的重復性。
2.2.8加樣回收率取已知含量的同一批次參柏濕疹搽劑1.5mL，混合對照1.5mL(其中黃柏堿∶樣品含量=2∶1，小檗堿∶樣品含量=2∶1)，再按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率。結果顯示，黃柏堿和小檗堿的平均加樣回收率分別為98.52%、95.6%，RSD分別為2.67%、2.96%(n=6)，表明該方法準確度較好，結果見表4。
2.2.9樣品含量測定取3個批次(批號20200423、20200522、20200624)參柏濕疹搽劑樣品各一瓶，按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液各3份，供試品溶液及混合對照品溶液各20μL，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品中黃柏堿和小檗堿的含量。結果顯示，3個批次樣品中黃柏堿、小檗堿的平均含量分別為25.39μg/mL、84.99μg/mL。根據3批樣品含量測定結果可知，制劑中黃柏堿含量的平均值為12.70mg/瓶，小檗堿含量的平均值為42.50mg/瓶，按平均含量的80%設限，初步擬定以黃柏堿每瓶制劑中不得少于10mg、小檗堿每瓶制劑中不得少于34mg。樣品中黃柏堿、小檗堿含量測定結果見表5。
3討論
苦參和黃柏是參柏濕疹搽劑方中的君藥，所以選擇對苦參和黃柏進行定量檢測，以苦參中主要有效成分苦參堿、氧化苦參堿，黃柏中的主要有效成分黃柏堿和鹽酸小檗堿為檢測指標建立了高效液相色譜含量測定方法。因為中藥復方制劑中苦參堿和氧化苦參堿在一定條件下可以相互轉化，所以選擇苦參堿和氧化苦參堿的總量為檢測指標。
苦參堿和氧化苦參堿加樣對照品的配制方法，開始做加樣回收率不理想，排除對照品經過樣品處理方法會發生變化的可能，考慮到配制對照品的溶劑為0.1%磷酸水，而樣品為水溶液，加入樣品后可能會對含量產生影響，故調整對照品的配置溶劑為蒸餾水。考慮到制定標準曲線所用對照品的配制溶劑為0.1%磷酸水，在測加樣回收樣品前，測試樣品含量，對照品含量，經過調整后，加樣回收率正常。
黃柏堿和小檗堿對照品配制溶劑，檢測黃柏堿和小檗堿時樣品處理為取2.5mL樣品，加入1%鹽酸甲醇定容至5mL，目標峰型較好。對照品的配制原來使用50%的甲水配制，在加樣回收時小檗堿回收率不理想。嘗試甲醇，50%甲水和1%鹽酸甲醇配制后，發現小檗堿的吸收峰面積會隨著配制溶劑的不同而發生較明顯的變化，故決定將對照品配制溶劑改為50%(1%鹽酸)甲醇水，與樣品處理后的溶劑一致，小檗堿的回收率也正常了。
綜上所述，本研究建立了參柏濕疹搽劑中苦參堿、氧化苦參堿和黃柏堿、小檗堿的HPLC含量測定方法，并初步擬定了苦參堿和氧化苦參堿總量計，每瓶不少于99mg，黃柏堿、小檗堿每瓶分別不少于10mg和34mg的質量標準。——論文作者：曾金，李萍，歐人豪，肖萍*
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