發布時間：2021-03-02所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：探討不飽和脂肪酸對人脂肪間充質干細胞(adipose-derivedstemcells,ADSCs)的形態、增殖、免疫表型及分化潛能的影響。采用0.15%Ⅷ型膠原酶消化法從皮下脂肪組織中分離獲得ADSCs，使用添加了油酸或亞麻酸的培養基對ADSCs進行傳代培養，倒置顯微鏡下觀察細
摘要：探討不飽和脂肪酸對人脂肪間充質干細胞(adipose-derivedstemcells,ADSCs)的形態、增殖、免疫表型及分化潛能的影響。采用0.15%Ⅷ型膠原酶消化法從皮下脂肪組織中分離獲得ADSCs，使用添加了油酸或亞麻酸的培養基對ADSCs進行傳代培養，倒置顯微鏡下觀察細胞形態，計數法繪制細胞生長曲線，流式細胞術檢測細胞表面抗原，同時使用特定的誘導培養基對細胞進行成脂、成骨、成軟骨誘導培養和染色鑒定，并采用實時定量PCR檢測三系分化誘導培養9d后成脂、成骨及成軟骨相關標志基因mRNA的表達水平。結果顯示，0.15%Ⅷ型膠原酶消化法能獲得形態均一的ADSCs;培養相同的時間后，與未添加脂肪酸的空白對照組相比，含有20μmol/L油酸或亞麻酸的培養體系中所收獲ADSCs的細胞數量增加了20%左右;各組細胞CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105呈陽性表達，CD31、CD45呈陰性表達;使用20μmol/L油酸或亞麻酸進行傳代培養的細胞經成脂、成骨、成軟骨誘導后，油紅O、茜素紅、阿利新藍染色呈陽性反應，同時細胞中的成脂標志基因PPAR-γ、成軟骨標志基因SOX9和COL2A1及成骨標志基因ALP、OCN、RUNX2的mRNA表達水平較對照組顯著增加。實驗結果表明油酸及亞麻酸能夠促進ADSCs增殖，維持細胞的免疫表型且提高細胞的三系分化潛能。
關鍵詞：脂肪間充質干細胞(adipose-derivedstemcells,ADSCs);不飽和脂肪酸;油酸;亞麻酸;生物學特性
人脂肪間充質干細胞(adipose-derivedstemcells,ADSCs)是存在于脂肪組織中的一種多潛能干細胞，在特定條件下可誘導分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等多種細胞[1]。ADSCs免疫原性低，可減少同種異體間移植的排斥，且具有旁分泌功能，可分泌多種生長因子及炎性因子[2]，在修復、替換、維持或增強組織和器官功能等研究領域顯示出強大的再生醫學功能，因此被廣泛應用于臨床研究[3]。據《中國醫藥生物技術協會》網站提供的信息(http://www.cmba.org.cn/common/index.aspx-nodeid=281&pagesize=1&pagenum=10.htm)，截至2020年11月，在國家衛生健康委員會備案的干細胞臨床研究機構增至111家，備案項目達100個，其中有5個臨床研究項目使用的細胞為ADSCs，包括廣東省中醫院開展的ADSCs治療中重度尋常型銀屑病的試驗;上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院開展的異體ADSCs治療膝骨關節炎的臨床研究;聊城市人民醫院開展的ADSCs治療中重度潰瘍性結腸炎及肺動脈高壓的臨床研究等。國內外多項ADSCs相關動物及臨床研究證實，ADSCs具有應用于糖尿病足[4]、心肌缺血[5]、腦損傷[6]等修復治療的潛力。
脂肪酸是生物體的供能物質和生物膜的重要組成部分，是膳食中重要的能量來源物質。脂肪酸根據飽和程度的不同可分為飽和脂肪酸(saturatedfattyacid,SFA)和不飽和脂肪酸(unsaturatedfattyacid,UFA)，其中不飽和脂肪酸又分為單不飽和脂肪酸(monounsaturatedfattyacid,MUFA)及多不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacid,PUFA)[7]。不飽和脂肪酸及其代謝產物是細胞結構和功能的重要組成部分，因此在干細胞命運調控方面具備特定的功能。2014年Kang等[8]在StemCells上發表的綜述中提到，Ω-6和Ω-3族PUFA及其代謝產物與細胞結構及功能有關，它們可以通過多種作用機制，影響不同來源間充質干細胞(mesenchymalstemcells,MSCs)的生物學特性，例如促進多種干細胞的增殖及分化，繼而影響干細胞的命運調控。目前，關于PUFA在干細胞分化中的作用研究主要集中在PUFA來源的代謝產物，包括花生四烯酸(arachidonicacid,AA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid,DHA)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoicacid,EPA)、前列腺素E2(prostaglandinE2,PGE2)、白三烯B4(leukotrieneB4,LTB4)、血栓素A2(thromboxaneA2,TXA2)和二十二碳五烯酸(docosapentaenoicacid,DPA)，而研究的細胞模型多以神經干細胞為主，對MSCs的研究較少[8-9]。只有少量研究涉及DHA、EPA和AA等對人臍帶、骨髓來源MSCs增殖或分化方面的影響[10-11]。三系分化能力是鑒定MSCs的標準之一，已有研究表明脂肪酸能影響體外培養的成肌干細胞的分化[12]，但目前尚未有研究報道脂肪酸對ADSCs三系分化能力的影響。本研究旨在體外分離、培養ADSCs，并應用不飽和脂肪酸作用于ADSCs，探究MUFA中的油酸和PUFA中的亞麻酸對ADSCs形態、增殖、免疫表型及分化潛能的影響，以期為ADSCs提供更優化的培養體系以及為脂肪酸應用于MSCs方面提供研究基礎。
1材料與方法
1.1材料脂肪組織取自東莞市第五人民醫院的志愿者，使用含2%青鏈霉素混合液的生理鹽水保存。
杜氏磷酸緩沖鹽溶液(Dulbecco'sphosphate-bufferedsaline,DPBS)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphatebuffersaline,PBS)、α-MEM(MEMalphabasic)培養基、0.125%胰酶(Gibco公司，美國);人血小板裂解液(Helios公司，美國);Ⅷ型膠原酶(Sigma公司，美國);油酸[>85.0%(SG)]、亞麻酸[>70.0%(SG)](梯希愛化成工業發展有限公司);MSC成脂誘導分化試劑盒、MSC成骨誘導分化試劑盒、MSC軟骨誘導分化試劑盒、阿利新藍、油紅O、茜素紅(賽業生物科技有限公司);青鏈霉素混合液、4%多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司);流式單抗PEmouseIgG1κisotypecontrol(PE-ISO，同型對照)、PEmouseanti-humanCD13、PEmouseanti-humanCD29、PEmouseanti-humanCD44、PEmouseanti-humanCD73、PEmouseanti-humanCD90、PEmouseanti-humanCD105、PEmouseanti-humanCD31、PEmouseanti-humanCD45(BD公司，美國);TriQuickReagent(北京索萊寶科技有限公司);QIAzolLysisReagent(QIAGEN公司，德國);逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR檢測試劑盒(TaKaRa公司，日本);ultrapuredistilledwater(Invitrogen公司，美國);BIOG血清血漿游離RNA提取試劑盒(常州百代生物科技股份有限公司)。
1.2ADSCs的分離、培養與傳代
取志愿者皮下脂肪組織，使用含2%青鏈霉素混合液的生理鹽水與脂肪組織充分混勻，400g離心7min后倒出脂肪組織，重復數次上述洗滌步驟，直至無明顯血液殘留。按照1∶1體積比加入0.15%Ⅷ型膠原酶溶液，充分混勻后置于37℃水浴鍋中消化30min，期間每隔5min混勻一次。消化完成后400g離心7min，棄上層脂肪，細胞沉淀重懸于含1%青鏈霉素混合液和5%人血小板裂解液的α-MEM培養基中。將細胞懸液用100μm細胞濾網過濾后接種于T-175培養瓶，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，培養72h后更換不含青鏈霉素混合液的培養基并除去未貼壁細胞，之后每隔3d換液，細胞融合度達80%后用0.125%胰酶消化2~3min，加入3倍體積的生理鹽水稀釋消化，以1∶3比例傳代，取第3~5代的細胞進行誘導增殖。
1.3油酸或亞麻酸誘導ADSCs增殖的最佳濃度篩選
油酸、亞麻酸分別使用含5%人血小板裂解液的α-MEM培養基稀釋成20μmol/L、40μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L的濃度梯度。將P5代ADSCs以每孔5×104個細胞的密度接種于6孔板，細胞過夜貼壁后將培養基換成2mL含不同濃度脂肪酸的培養基，以不加脂肪酸的培養基為空白對照組，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中繼續培養48h，吸棄舊培養液并用生理鹽水清洗，隨后用0.125%胰酶消化細胞，終止消化后，制備單細胞懸液。使用CounstarIM1200自動細胞計數儀(上海睿鈺生物科技有限公司)檢測細胞數量及細胞活率。
相關期刊推薦：《生命科學研究》主要反映世界各國生命科學領域中的最新研究成果，所刊登的論文90%來源于中國國家自然科學基金、國家科技部重大項目基金以及省級科學基金。本刊主要刊登國內外生命科學領域中的具有創造性的學術論文及少量反映國內外重大進展或熱點問題的快訊或綜述性文章，覆蓋的主要學科是：生物化學與分子生物學、發育生物學、細胞生物學、生物技術、遺傳學、植物學、動物學、微生物學、解剖學、生理學、基因工程、農業工程、病理學、毒理學、藥理學、免疫學、基礎醫學等等。
為優選最佳的使用濃度，首先設置大范圍的濃度梯度，得出合適的濃度范圍，再設置小范圍的濃度梯度來測定具體的數值。因此，將油酸、亞麻酸使用含5%人血小板裂解液的α-MEM培養基繼續稀釋成10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、25μmol/L、30μmol/L的濃度梯度。將P4代ADSCs以每孔2×104個細胞的密度接種于6孔板，細胞過夜貼壁后將培養基換成2mL含不同濃度脂肪酸的培養基，以不加脂肪酸的培養基為空白對照組，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中繼續培養72h，吸棄舊培養液并用生理鹽水清洗，隨后用0.125%胰酶消化細胞，終止消化后制備單細胞懸液并進行計數，比較各組的細胞數量及細胞活率。
1.4油酸或亞麻酸對ADSCs形態的影響及生長曲線繪制
取5×104個ADSCs(P3代)接種于10cm的培養皿中，細胞過夜貼壁后將培養基換成10mL含20μmol/L油酸或亞麻酸的完全培養基(含5%人血小板裂解液的α-MEM培養基)，以不加脂肪酸為空白對照組，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。每隔24h在各組中隨機選擇3個培養皿，吸棄舊培養液并用生理鹽水清洗1次，吸棄生理鹽水后再加1mL的0.125%胰酶消化細胞，終止消化后，制備單細胞懸液，吹打混勻，取20μL細胞懸液與20μL0.2%臺盼藍溶液混勻后加樣到細胞計數板上，使用細胞計數儀檢測細胞數量及細胞活率(每孔取3個視野計數后取平均值進行統計分析)，以時間為橫軸，總細胞個數為縱軸繪制細胞生長曲線。各組細胞培養48h后，在顯微鏡下觀察并記錄其形態是否有差異。
1.5流式細胞術檢測細胞免疫表型
取P3代細胞以4500cm-2的密度接種于T-175培養瓶，細胞過夜貼壁后將培養基換成含20μmol/L油酸或亞麻酸的完全培養基繼續培養，以不加脂肪酸為空白對照組，細胞融合度達90%后，取各組細胞進行流式細胞術分析。流式細胞術檢測的具體步驟如下：收集各組ADSCs并使用1mLPBS重懸細胞后計數，將1mL細胞懸液均分至11個EP管中，每個EP管中的細胞數量為2.2×105個，3000r/min離心6min，小心棄上清后再加入25μL的PBS重懸細胞沉淀，將流式單抗PE-ISO(同型對照)及CD13、CD29、CD31、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105對應的抗體各取5μL加入相應的EP管中，陰性對照組加入5μL的DPBS(未染色的細胞即為陰性對照)，混勻后4℃冰箱避光孵育30min。孵育終止后，每管加入500μL的PBS洗滌樣品，3000r/min離心6min，小心棄上清。洗滌兩次后加入200μL的PBS重懸，將細胞懸液轉移到流式管中，采用流式細胞術分析細胞表面抗原的表達情況。
1.6細胞三系分化能力檢測
取P3代的ADSCs細胞以4500cm-2的密度接種于T-175培養瓶，細胞過夜貼壁后將培養基換成含20μmol/L油酸或亞麻酸的完全培養基繼續培養，以不加脂肪酸為空白對照組，細胞融合度達90%后，取各組細胞進行成脂、成骨、成軟骨誘導培養并染色鑒定。
成脂分化能力檢測：取4.5×105個ADSCs接種到裝有2mLMSC培養基的6孔板中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。待細胞融合度達到90%時，換成2mLMSC成脂分化培養基A液[含10%胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、地塞米松、胰島素、吲哚美辛];3d后更換為2mL培養基B液(含胰島素及10%FBS);24h后再更換成A液誘導，循環誘導7d后使用油紅O染液進行染色鑒定。
成骨分化能力檢測：取4.5×105個ADSCs接種到裝有1mLMSC培養基的12孔板中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。待細胞長到基本融合時，更換1mLMSC成骨分化培養基，每隔2d更換一次MSC成骨分化培養基，培養14d后使用茜素紅進行染色鑒定。
成軟骨分化能力檢測：收集各組細胞并制備成單細胞懸液，計數后取出含有1.0×106個ADSCs的細胞懸液，1200r/min離心獲得細胞沉淀，吸棄上清后加入10μLMSC培養基重懸細胞沉淀，取5μL細胞沉淀置于24孔板，以形成細胞微團。將細胞置于培養箱中培養，2h后向24孔板中加入1mLMSC成軟骨誘導分化培養基，每隔2d換一次MSC成軟骨誘導分化培養基，培養14d后使用阿利新藍染液進行染色鑒定。
1.7Q-PCR檢測成骨、成軟骨及成脂分化相關標志基因的表達水平
取P3代細胞以4500cm-2的密度接種于T-175培養瓶，細胞過夜貼壁后將培養基換成含20μmol/L油酸或亞麻酸的培養基繼續培養。細胞融合度達90%后，取1×106個細胞接種到裝有2mL完全培養基的6孔板中，每組重復2個孔，培養24h后更換特定的誘導培養基進行成脂、成骨、成軟骨誘導培養。誘導9d后根據QIAZolLysisReagent說明書分別提取各組ADSCs的總RNA，并用微量分光光度儀檢測RNA的濃度和純度，隨后根據逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA。以cDNA作為模板，以GAPDH為內參，采用Q-PCR檢測成脂標志基因PPAR-γ(peroxisomeproliferator-activatedreceptor-γ)、成軟骨標志基因SOX9(SRY-relatedprotein9)和COl2A1(typeIIcollagen-A1)以及成骨標志基因ALP(alkalinephosphatase)、OCN(osteocalcin)、RUNX2(runt-relatedtranscriptionfactor2)的mRNA表達水平。上下游引物均是根據NCBI提供的mRNA序列，使用Primer3Plus軟件設計，由上海生工生物工程股份有限公司最終合成。PCR引物序列見表1。——論文作者：李錦靈，林立龍，李治寰
SCISSCIAHCI
