發布時間：2020-03-11所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要: 泛素化修飾是真核生物細胞內重要的翻譯后修飾類型，通過調節蛋白質活性、穩定性和亞細胞定位廣泛參與細胞內各項信號傳導與代謝過程，對維持正常生命活動具有重要意義。組蛋白作為染色質中主要的蛋白成分，與 DNA 復制轉錄、修復等行為密切相關，是研究
摘要: 泛素化修飾是真核生物細胞內重要的翻譯后修飾類型，通過調節蛋白質活性、穩定性和亞細胞定位廣泛參與細胞內各項信號傳導與代謝過程，對維持正常生命活動具有重要意義。組蛋白作為染色質中主要的蛋白成分，與 DNA 復制轉錄、修復等行為密切相關，是研究翻譯后修飾的熱點。DNA 損傷后，組蛋白泛素化修飾通過調節核小體結構、激活細胞周期檢查點、影響修復因子的招募與裝配等諸多途徑參與損傷應答。同時，組蛋白泛素化修飾還能調節其他位點翻譯后修飾，并通過這種串擾(crosstalk)作用調節 DNA 損傷應答。本文介紹了組蛋白泛素化修飾的主要位點和相關組分(包括 E3 連接酶、去泛素化酶與效應分子)，以及這些修飾作用共同編譯形成的信號網絡在 DNA 損傷應答中的作用，最后總結了目前該領域研究所面臨的一些問題，以期為科研人員進一步探索組蛋白密碼在 DNA 損傷應答中的作用提供參考。
關鍵詞: 組蛋白;泛素化修飾;DNA 損傷應答;串擾
DNA 是真核生物遺傳信息的載體，其遺傳保守性是維持物種相對穩定的基礎。然而，各種內源性或外源性因素造成的 DNA 損傷如不能及時修復，將導致細胞凋亡甚至癌變。因此，生物體在進化過程中形成了復雜的 DNA 損傷應答 (DNA damage response, DDR)機制，以應對各種 DNA 損傷壓力。組蛋白是真核生物染色質中主要的蛋白成分，包括 H1、H2A、H2B、H3 和 H4 五種類型。約 146 bp 的 DNA 通過左手螺旋的方式環繞由 2 分子 H2A-H2B 二聚體和 1 分子 H3-H4 四聚體組成的核心顆粒 1.75 圈，形成核小體輔助 DNA 折疊[1,2]。
組蛋白 N 端含有大量精氨酸、賴氨酸殘基，是主要的翻譯后修飾位點。組蛋白在各修飾酶、去修飾酶共同編譯下形成組蛋白密碼(histone code)，構成了 DDR 中精密的信號網絡[3]。近年來，組蛋白泛素化修飾在 DDR 中的作用愈發受到關注。組蛋白泛素化修飾可以通過調節核小體結構、激活細胞周期檢查點、影響修復因子的招募與裝配等途徑參與 DDR。此外，組蛋白修飾之間還存在交互作用，一位點修飾能促進或抑制其他位點的修飾[4,5]。組蛋白泛素化修飾同樣可以通過這種串擾(crosstalk)作用調節其他類型翻譯后修飾作用于 DDR。本文介紹了組蛋白泛素化修飾的各主要位點和相關的 E3 連接酶、去泛素化酶與效應分子，以及這些修飾作用共同編譯形成的信號網絡在 DDR 中的作用。
1 泛素與泛素化修飾
泛素(ubiquitin, ub)是由 76 個氨基酸組成的多肽，廣泛存在于真核生物體內。泛素分子高度保守，在動物、植物和酵母菌中其一級結構僅有 1~3 個氨基酸殘基不同，三級結構基本相同[6]。泛素分子在激活酶(E1)、結合酶(E2)和連接酶(E3)的作用下連接于底物，形成單泛素化修飾。泛素分子還可依次連接于前一泛素分子的賴氨酸或甲硫氨酸殘基形成泛素鏈，稱多聚泛素化修飾。連接位點有第 6、11、27、 29、33、48、63 位賴氨酸殘基和第 1 位甲硫氨酸殘基(K6/11/27/29/33/48/63-linked and M1-linked) 8 種類型。
泛素化修飾是泛素–蛋白酶體途徑(ubiquitinproteasome pathway, UPP)的重要步驟，介導了細胞內短壽蛋白和錯誤折疊蛋白通過 26S 蛋白酶體降解。此外，泛素化修飾還能調節蛋白在細胞內的定位與活性，廣泛參與 DNA 復制轉錄、損傷應答、炎癥反應、免疫應答、細胞周期與凋亡、囊泡運輸等諸多生理過程[7~11]。不同的效應往往與泛素鏈不同的拓撲結構有關，例如 K11/48 連接的泛素鏈主要參與蛋白質降解，K63 連接的泛素鏈主要參與 DNA 損傷應答與信號轉導，而 M1 連接的泛素鏈則主要參與免疫應答與炎癥反應[12]。
2 H2A 多位點泛素化修飾參與 DDR
H2A 泛素化修飾最早于 1975 年發現，首個修飾位點定位于 K119 (第 119 位賴氨酸，同下)，后又陸續在 K13/15 和 K127/129 等位點發現泛素化修飾[13,14]。 H2A 各位點泛素化修飾介導多種生物學效應，對修復進程進行調控，在 DNA 雙鏈斷裂(double-strand breaks, DSBs)和紫外線造成的 DNA 損傷(UV-induced DNA damage)應答中起重要作用。
2.1 沉默損傷周圍基因
哺乳動物細胞核內約 5%~15%的 H2A 處于單泛素化修飾狀態，其中以 H2AK119 單泛素化修飾為主。 H2AK119 單泛素化修飾參與抑制 RNA Pol Ⅱ延伸、多梳蛋白家族(polycomb group proteins, PcG)基因沉默、X 染色體失活和抑制趨化因子基因表達等諸多生理過程 [15~17] 。多梳抑制復合體 1 (polycomb repressive complex 1, PRC1)是 PcG 家族成員，其亞基環指蛋白 2 (ring finger protein 2, RING2)是單泛素化修飾 H2AK119 的 E3 連接酶，通過第 98 位精氨酸殘基嵌入 H2A-H2B 二聚體間縫隙定位催化反應。由于缺乏活性精氨酸/賴氨酸殘基，RING2 還需與 PRC1 另一亞基 BMI-1 結合形成異二聚體才能充分發揮其催化活性。異二聚體形成有助于穩定 E2~ub 結構，促進泛素分子傳遞，BMI-1 缺失將嚴重影響 RING2 活性[18]。
H2AK119單泛素化修飾可與 PcG家族另一成員 PRC2 催化的 H3K27 三甲基化修飾相互串擾，即 PRC1 的 CBX 亞基識別 H3K27 三甲基化修飾定位，單泛素化修飾 H2AK119;PRC2 的 JARID2 亞基識別 H2AK119 單泛素化修飾定位，三甲基化修飾 H3K27[19]。這種交叉招募可極大地提高損傷位點附近 H2AK119 單泛素化修飾水平。
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近年來，已有關于RING2/BMI-1催化的H2AK119 單泛素化修飾參與 DSBs 修復的研究報道，如在損傷早期調節 γH2AX 生成、影響修復因子招募以及輔助 DNA 定位于核仁周圍等，但具體機制尚未明確[20,21]。目前，H2AK119 單泛素化修飾在 DSBs 修復中較為明確的作用是實現損傷位點周圍數千堿基對范圍內基因沉默，抑制損傷區域的復制、轉錄行為，減少錯誤產物的生成，為 DNA 修復創造條件[22,23]。然而， Chandler 等[24]在 AsiSI 限制酶誘導的 DSBs 周圍并未發現 PRC1 聚集，對上述理論提出挑戰。此外，還有證據表明除參與 DSBs 修復外，細胞核內儲備的 K119 單泛素化修飾的 H2A還可在分子伴侶 CAF-1的輔助下定位于 UV 損傷周圍，并通過共濟失調毛細血管擴張癥 Rad3 相關蛋白激酶(ATM and Rad3 related kinase, ATR)依賴的途徑參與核苷酸切除修復(nucleotide excision repair, NER)后染色質重塑[25,26]。
2.2 調節 DNA 斷端剪切
同源重組修復(homologous recombination, HR)和非同源斷端連接(non-homologous end joining, NHEJ) 是細胞修復 DSBs的兩種重要方式。BRCA1和 53BP1 分別是 HR 和 NHEJ 中重要的效應分子，二者相互競爭，又彼此協同。BRCA1 通過易化 DNA 斷端剪切，促進 HR;相反，53BP1 則在 DNA 斷端兩側限制 DNA 剪切長度，防止過度剪切造成的 DNA 單鏈復性和染色體重排，易化 NHEJ。BRCA1 和 53BP1 在不同位點被招募并級聯不同的后續效應，共同決定兩種修復方式間的平衡[27](圖 1A)。
環指蛋白 8 (ring finger protein 8, RNF8)和環指蛋白 168 (ring finger protein 168, RNF168)催化的 H2A/H2AXK13/15 泛素化修飾，是 BRCA1 和 53BP1 招募過程中的重要信號。RNF8 和 RNF168 的聚集，依賴于 ATM 和 DNA 損傷檢測點介質 1 (mediator of DNA damage checkpoint 1, MDC1)的作用。ATM 檢測到 DSBs 后，磷酸化修飾 H2AX 和 MDC1。磷酸化 MDC1 的 BRCT 結構域識別 γH2AX 定位于損傷位點，作為腳手架招募 RNF8[28,29]。早期認為由 RNF8 直接多聚泛素化修飾 H2A/H2AXK13/15 招募修復因子[30]，或首先由 RNF8 單泛素化修飾 H2A/H2AXK13/ 15 招募 RNF168，再由 RNF168 延伸 K63 連接的泛素鏈招募修復因子[31]。然而實驗中發現 RNF8 在體內對核小體中 H2A/H2AX 缺乏親和力，卻具有延伸 K63 連接的泛素鏈的能力。近年來的研究對這一過程逐漸有了清晰的認識：RNF8 被招募至損傷位點后首先多聚泛素化修飾 H1(K63 連接的泛素鏈)招募 RNF168，由后者單泛素化修飾 H2A/H2AXK13/15，最后再由 RNF8 延伸 K63 連接的泛素鏈，招募修復因子[32,33]。
BRCA1 是 H2A/H2AXK13/15 多聚泛素化修飾招募的修復因子之一，實際上 BRCA1 與 RAP80、 Abraxas、MERIT40、BRCC36、BRCC45 和 BARD1 形成 BRCA-A 復合體共同被招募[34]。該復合體以 Abraxas為核心組裝，RAP80負責識別泛素鏈定位[35]。 BRCA1-A 復合體能限制 DNA 斷端剪切，防止 HR 過度激活[34]。去泛素化酶 BRCC36 清除 K63 連接的泛素鏈，被認為在該過程中發揮主要作用[36]。53BP1 是另一個被招募的修復因子，與 BRCA1 不同，53BP1 通過識別 H2AK15 單泛素化修飾定位[37,38]。53BP1 可在損傷位點與剪切酶競爭，調整 DNA 斷端剪切長度。同時，53BP1 還可作為腳手架，促進修復因子組裝[39]。BRCA1-A 復合體和 53BP1 的協同作用有效避免了 DNA 斷端過度剪切，使細胞傾向于通過 NHEJ 途徑修復 DSBs。
K127/129 單泛素化修飾是新近發現的第 3 個參與 DSBs 修復的 H2A 泛素化修飾類型，由 BRCA1-C 復合體催化。BRCA1-C 復合體包含 BRCA1/BARD1 二聚體、DNA 內切酶 CtIP 和 MRN 復合體 3 種成分， BRCA1 是主要的 E3 活性單位[40]。與 RING2/BMI-1 二聚體相似，BRCA1 需與 BARD1 結合才能充分發揮其催化活性[41]。BRCA1/BARD1 在異染色質蛋白 HP1 的輔助下定位至損傷中心區域催化 H2AK127/ 129 單泛素化修飾，后者可被 SMARCAD1 的 CUE 結構域識別[42]。SMARCAD1 依賴其 ATP 酶活性將 53BP1 重新定位于損傷外圍，易化 CtIP 在 MRN 復合體輔助下剪切 DNA 斷端，促進以高保真的 HR 修復 DSBs[41,43~45]。值得一提的是，BRCA1 還可形成 BRCA1-B/D 復合體，分別通過調節細胞周期和促進鏈侵入的方式參與 DDR[34]。
2.3 輔助起始 NER
除 RING2/BMI-1 外，H2AK119 單泛素化修飾還可由 DDB1-CUL4DDB2 復合體催化，輔助起始 NER[46]。NER 是應對 UV 造成的 DNA 損傷的主要方式，除修復環丁烷嘧啶二聚體(cyclobutane pyrimidine dimers, CPDs)和 6-4 光產物[(6-4) photoproducts, 6-4 PPs]外，NER 還可廣泛地識別多種損傷，與其特殊的識別機制有關。XPC 是全基因組 NER 中主要的識別因子，可識別 DNA 發生修飾 ( 損 傷 ) 且 Waston-Crick 堿基配對破壞時形成的不穩定結構，而非損傷本身[47]。CPDs 本身不足以引起 DNA 螺旋結構的不穩定，因此還需 DDB1-CUL4DDB2 復合體的輔助才能激活 NER。該復合體由 E3 連接酶 CUL4 和紫外線損傷 DNA 結合蛋白(UV-damaged DNA-binding protein, UV-DDB)組成，其中 UV-DDB 包括 DDB1 與 DDB2 兩種類型，DDB1 位于 CUL4 的 N 端，是連接 CUL4 與 DDB2 的橋梁。DDB2 通過 WD40 結構域識別 CPDs 后招募 DDB1-CUL4 至損傷位點[48]。正常情況下，CUL4 的活性受 COP9 信號體抑制，激活則依賴 NEDD8 類泛素化修飾[49]。
正常細胞在 UV 損傷后 H2AK119 單泛素化修飾水平迅速下降，DDB1-CUL4DD2 復合體在 H2AK119 單泛素化修飾水平的恢復中起重要作用。H2AK119 單泛素化修飾能有效促進 H2A/H2A-H2B 從核小體解離，加劇 DNA 螺旋結構的不穩定性，促進 XPC 識別[50]。同時，DDB2、XPC 均是 DDB1- CUL4DDB2 泛素化修飾的底物，DDB2 泛素化修飾后可被分子伴侶 VCP/p97 識別，介導 DDB2 通過 UPP 降解，解除位阻效應，促進后續 NER 進程[51,52]。XPC 泛素化修飾可增強其與 DNA 的親和力，促進其與損傷 DNA 結合[52,53](圖 1B)。
目前認為， DDB1-CUL4DDB2 單泛素化修飾 H2AK119 是發生在 NER 早期的事件，輔助 XPC 對損傷 DNA 的識別，激活 NER。RING2/BMI-1 單泛素化修飾 H2AK119 則更多的以剪切后事件的形式發生于 NER 后期，通過 CAF-1 和 ATR 依賴的途徑參與染色質重塑[25,26]。
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