發布時間：2020-02-28所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要背景：脂肪干細胞的提取及純化流程尚未建立統一標準。最常用的純化脂肪干細胞的方法是利用紅細胞裂解液處理基質血管成分。但這一步驟是否對脂肪干細胞存在不良影響仍缺乏證據，是否有利于未來臨床應用仍有待探討。目的：比較氯化銨紅細胞裂解液法和非裂
摘要背景：脂肪干細胞的提取及純化流程尚未建立統一標準。最常用的純化脂肪干細胞的方法是利用紅細胞裂解液處理基質血管成分。但這一步驟是否對脂肪干細胞存在不良影響仍缺乏證據，是否有利于未來臨床應用仍有待探討。目的：比較氯化銨紅細胞裂解液法和非裂解法提取脂肪干細胞的效率，并進一步比較兩種方法提取脂肪干細胞的生物學特性。方法：收集吸脂手術患者脂肪組織，經Ⅰ型膠原酶消化后，利用或不用氯化銨紅細胞裂解液對基質血管成分進行純化，MuseTM細胞狀態分析儀對活細胞計數及活細胞比例評估;將基質血管成分接種后培養人脂肪干細胞至第2代，光學顯微鏡觀察脂肪干細胞形態，流式細胞學分析脂肪干細胞表型，CCK-8法繪制細胞增殖曲線，成脂及成骨培養基誘導后油紅O及茜素紅染色法分別評估成脂、成骨分化能力。該實驗經中國醫學科學院整形外科醫院倫理委員會批準，并與患者簽署相關知情同意書。結果與結論：①與裂解組相比，非裂解組提取即刻的基質血管成分中非紅活細胞數更多，活細胞百分比更大;②兩組脂肪干細胞均呈梭形、魚群狀排列;③兩組細胞均高表達CD90、CD73、CD105等細胞表面抗原，低表達或不表達CD11b、CD34、CD19、CD45、HLA-DR等細胞表面抗原;④非裂解組細胞增殖速度更快，成脂及成骨能力兩組間無明顯區別;⑤結果表明，利用氯化銨紅細胞裂解液法提取基質血管成分降低了脂肪干細胞提取效率，抑制了脂肪干細胞增殖能力。非裂解過程不影響脂肪干細胞表型及成脂、成骨分化能力。因此不建議在人脂肪干細胞提取過程中進行氯化銨法紅細胞裂解。
關鍵詞：紅細胞裂解液;細胞提取;脂肪干細胞;細胞活性;細胞表型;細胞增殖
0引言Introduction脂肪干細胞是一群從脂肪組織中獲取的中胚層來源的多能成體干細胞，具有自我更新及多向分化潛能[1]，其獲取方法微創，組織來源豐富，具有重要的臨床應用價值[2-3]。然而，目前體外擴增脂肪干細胞的方法還有待標準化，如培養基使用種類、細胞接種密度等[4]，這成為學者們不斷研究的方向[5]。
相關期刊推薦：《中國組織工程研究》雜于1997年創辦，發表組織工程研究中關于干細胞培養與移植、組織構建、材料生物相容性評價(天然或合成材料與納米粒子、人工材料植入體、植入器官及外源性細胞)、計算機輔助骨外科技術的應用基礎及臨床研究，轉化醫學和循證醫學研究的文章，發表中國組織工程研究領域一流水平的學術、技術創新成果。
目前在提取脂肪干細胞的過程中多包含紅細胞裂解步驟[1，6-7]，其目的是純化細胞組分，便于原代脂肪干細胞提取。含有氯化銨的紅細胞裂解液可能具有潛在毒性，目前尚無臨床級的脂肪干細胞裂解液[8]。紅細胞裂解過程是否影響脂肪干細胞活力、表型、增殖及分化能力，目前相關研究較少。該研究旨在探討利用紅細胞裂解液提取脂肪干細胞是否為必要步驟，以優化人脂肪干細胞提取過程。
1材料和方法Materialsandmethods
1.1設計細胞生物學對比觀察。
1.2時間及地點2018年2月至2019年5月在中國醫學科學院整形外科醫院研究中心完成。
1.3材料
1.3.1脂肪組織實驗所用脂肪組織取自中國醫學科學院整形外科醫院行吸脂手術的9名患者，均為女性，年齡25-39歲，中位年齡32歲，體質量指數18.59-24.98kg/m2，見表1。無全身代謝及內分泌疾病，無腫瘤病史及腫瘤家族史，無酗酒及吸煙史，無服用利尿劑等影響糖類脂類代謝藥物史。實驗經中國醫學科學院整形外科醫院倫理委員會批準，并與患者簽署相關知情同意書。
1.3.2實驗試劑及儀器胎牛血清(Gibco公司);Ⅰ型膠原酶(Sigma公司);青鏈霉素、DMEM低糖培養基(Hyclone公司);紅細胞裂解液、HumanMSCAnalysisKit(BD公司);MuseTMcellanalyzer(Millipore公司);流式細胞儀(BD公司);CCK-8(碧云天公司);人脂肪間充質干細胞成脂誘導培養基、人脂肪間充質干細胞成骨誘導培養基(Cyagen公司);倒置相差顯微鏡(Olympus公司);酶標儀(EnSpire公司)。
1.4實驗方法
1.4.1分離細胞基質成分無菌條件下獲取脂肪抽吸物，每例吸脂脂肪標本均在獲取后12h內進行基質血管成分的提取操作。將人脂肪抽吸物用DPBS清洗，1000r/min離心5min后去除上層油層及下層液體層，留取中間脂肪層，記錄剩余脂肪組織的體積。將每例脂肪樣本均分2份，每份20mL，于終質量濃度為0.01g/L的Ⅰ型膠原酶中37℃搖床(100r/min)消化1h，加入含體積分數為10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM低糖培養基以中和膠原酶的作用，1200r/min離心10min，棄上清。非裂解組加入20mL低糖DMEM培養基重懸細胞，渦旋均勻后室溫放置15min，100目濾網過濾，加入20mL低糖DMEM培養基1000r/min離心5min，棄上清，該步驟重復2次后加入低糖DMEM培養基重懸細胞制備細胞懸液。裂解組采用20mL1×紅細胞裂解液重懸細胞沉淀，渦旋均勻后室溫放置15min，此后步驟同非裂解組。采用MuseTM細胞狀態分析儀計數懸液中活細胞百分比及活細胞數。將細胞懸液分裝入75cm2培養瓶，于37℃、體積分數為5%CO2條件下培養。待細胞80%融合后，TrypLETMExpress進行消化，以1∶2比例傳代。來自不同供體的第2代細胞進行各項分析。
1.4.2基質血管成分細胞計數及活細胞百分比測定提取即刻基質血管成分細胞懸液，利用MuseTM計數和活力試劑盒分析活死細胞。簡言之，取20μL細胞懸液，加于380μLMuseTM細胞計數和活力檢測試劑，吹打均勻，室溫避光放置5min。設置儀器稀釋系數為1∶20，用MuseTM細胞狀態分析儀對基質血管成分細胞懸液中活細胞數及活細胞百分比進行檢測。
1.4.3細胞表型檢測利用人間充質干細胞表型檢測試劑盒對以下表面標記進行檢測：CD90、CD44、CD105、CD73、CD11b、CD34、CD19、CD45、HLA-DR。利用人間充質干細胞表型檢測試劑盒對如上標記進行檢測。取第2代脂肪干細胞，消化后制成單細胞懸液，調細胞濃度為1×106L-1。取1mL單細胞懸液置于1.5mLEP管中，1000r/min離心5min，棄上清后加入100μLDPBS緩慢吹打、重懸細胞，按照說明書在不同的EP管加入鼠抗人抗體，4℃避光孵育30min，1000r/min離心5min后棄上清，DPBS沖洗并再次離心后吸凈上清，用500μLDPBS重懸細胞，加入40g/L多聚甲醛溶液固定細胞。使用BD流式細胞儀分析細胞表型，FlowJo軟件對所得數據進行分析。
1.4.4CCK-8法繪制細胞增殖曲線取第2代脂肪干細胞，消化后制成單細胞懸液，以每孔2000個細胞密度接種于96孔培養板，每孔加入100μL細胞懸液。依據培養時間設24個復孔，另外再設置8個空白調零孔(無細胞，只加入等量完全培養基)，放入細胞培養箱內預培養。配置CCK-8、培養基混合液，體積比為1∶10，分別于第0-7天輕輕吸取設定孔內上清液100μL，向孔內加入CCK-8、培養基混合液110μL，輕柔水平振蕩混勻，放入培養箱孵育4h。用酶標儀測定波長450nm處各孔吸光度，復孔讀數(平均值)與調零孔讀數(平均值)的差值即為最終吸光度值;根據每個時間點的最終吸光度值繪制細胞增殖曲線。
1.4.5脂肪干細胞成脂誘導及油紅O染色第2代脂肪干細胞消化重懸后計數，以2×104個/cm2細胞密度接種于6孔板，每孔加入2mL細胞懸液。當細胞匯合達到80%時，開始更換成脂誘導培養基。根據賽業人脂肪間充質干細胞成脂誘導試劑盒說明書進行成脂誘導，持續誘導9d，進行油紅O染色：吸去培養皿中成脂誘導培養基，DPBS輕輕漂洗2次，40g/L多聚甲醛室溫固定30min;吸除多聚甲醛，DPBS漂洗3次，每孔加入油紅O工作液1mL，37℃孵育30min;吸除油紅O工作液，DPBS漂洗2次，在相差倒置顯微鏡下進行觀察和圖像采集。Imagepro軟件分析成脂水平。
1.4.6脂肪干細胞成骨誘導及茜素紅染色第2代脂肪干細胞消化重懸后計數，以2×104個/cm2細胞密度接種于6孔板，每孔加入2mL細胞懸液。當細胞匯合達到80%時，開始更換成骨誘導培養基。根據賽業人脂肪間充質干細胞成骨誘導試劑盒說明書進行成骨誘導，每隔3d換液1次，持續誘導14d，進行茜素紅染色：吸去培養皿中成骨誘導培養基，DPBS輕輕漂洗2次，40g/L多聚甲醛室溫固定30min;吸除多聚甲醛，DPBS漂洗3次，每孔加入1mL茜素紅染液，37℃孵育5min，吸除茜素紅染液，DPBS漂洗2次，在相差倒置顯微鏡下進行觀察和圖像采集。Imagepro軟件分析成骨水平。
1.5主要觀察指標①基質血管成分中活細胞濃度及百分比;②脂肪干細胞表型;③脂肪干細胞增殖能力;④脂肪干細胞成脂、成骨分化能力。
1.6統計學分析采用SPSS23.0及GraphPadPrism8醫學統計軟件進行分析，計量資料以x_±s表示，進行配對t檢驗，P<0.05為差異有顯著性意義。
2結果Results
2.1非裂解組提取即刻活細胞數及活細胞比率優于裂解組為了驗證MuseTM細胞狀態分析儀是否可以排除非裂解組基質血管成分中的紅細胞，將裂解組的細胞門應用于非裂解組進行細胞計數，即獲得非裂解組的非紅細胞活細胞數;重新上樣后重新對非裂解組設門，再次進行非裂解組的細胞計數及活力分析;將兩個門獲得的活細胞數進行比較。經配對t檢驗，兩組活細胞數：應用非裂解組門計數得到細胞濃度為(4.25±2.55)×109L-1，應用裂解組門計數得到細胞濃度為(4.17±2.52)×109L-1，P=0.921，差異無顯著性意義，即提示MuseTM細胞狀態分析儀可對非裂解組細胞進行非紅細胞計數，見表2。進一步比較非裂解組與裂解組提取即刻細胞計數與活力，經配對t檢驗，非裂解組細胞數量為(5.59±2.47)×109L-1，裂解組細胞數量為(1.86±1.01)×109L-1，差異有顯著性意義(P=0.001)，非裂解組基質血管成分提取即刻活細胞數更多，見表2。非裂解組細胞活力百分比為(65.91±3.47)%，裂解組細胞活力百分比為(60.20±5.13)%，差異有顯著性意義(P=0.019)，見表2及圖1。
2.2原代培養人脂肪間充質干細胞形態原代細胞為梭形，可見混雜非梭形貼壁細胞，見圖2A。第2代脂肪干細胞幾乎完全呈長梭形生長，呈魚群狀排列，見圖2B。
2.3第2代脂肪干細胞表型根據流式細胞儀檢測結果，CD90、CD73、CD105等細胞表面抗原標記物呈現高表達，CD11b、CD34、CD19、CD45、HLA-DR等細胞表面抗原標記物呈現低表達或無表達，兩組細胞間表面抗原比例差異無顯著性意義，見圖3。
2.4兩組脂肪干細胞的增殖能力裂解組與非裂解組第2代人脂肪干細胞的增殖曲線均為近弧形,形態近似度高;接種后第7天，非裂解組吸光度值為0.70±0.19，裂解組吸光度值為0.66±0.19，兩組差異有顯著性意義(P=0.03)，見表2及圖4。
2.5兩組脂肪干細胞體外成脂分化能力相似將裂解組與非裂解組第2代人脂肪干細胞在體外進行成脂誘導分化，誘導第9天進行油紅O染色。非裂解組樣本彌散分布的紅色油滴更為明顯，染色結果行Imagepro半定量檢測(累積光密度值)：非裂解組為11350.00±3776.32;裂解組為11912.17±3324.47，差異無顯著性意義(P=0.79)，見表2及圖5。
2.6兩組脂肪干細胞體外成骨分化能力相似將裂解組與非裂解組第2代人脂肪干細胞在體外進行成骨誘導分化，誘導第14天進行茜素紅染色，兩組均可見彌散分布的紅色結節。染色結果行Imagepro半定量檢測(累積光密度值)：非裂解組為2846018.4±1993818.0，裂解組為2568546.0±2866366.2，差異無顯著性意義(P=0.86)，見表2及圖6。
3討論Discussion
脂肪干細胞由于產量高、容易獲取，是代替骨髓干細胞的重要干細胞來源[8]。人脂肪干細胞治療慢性潰瘍等已在許多臨床研究中報道[9-10]，此外其具有治療糖尿病、心血管疾病、瘢痕的潛能[11-13]。目前提取脂肪干細胞的過程主要步驟分為脂肪處理、膠原酶消化、終止消化、紅細胞裂解等步驟[6]。為了使人脂肪干細胞能夠進行臨床應用，在整個分離、擴增和移植過程中應遵循良好生產規范(GMP)指導原則[14]
裂解紅細胞的主要目的是純化混雜的基質血管成分細胞團，去除其中的紅細胞，以便于細胞貼壁后獲得相對同質的細胞群[15]。在細胞提取過程中常用含有氯化銨成分的紅細胞裂解液[16-18]，其作用機制為紅細胞內有大量的碳酸酐酶，可以自發將NH3轉化為NH4+，CO2轉化為HCO3-，促使胞外NH3和CO2連續內流而造成細胞裂解[15]。然而，目前尚無臨床級的紅細胞裂解液，此外脂肪組織內并無大量血液成分。因而紅細胞裂解步驟是否必要、無裂解步驟是否影響脂肪干細胞生物學特性仍有待探討。
該研究發現，提取基質血管成分即刻非裂解組活細胞數及活細胞比例優于裂解組，提示裂解液成分可能對有核細胞的活性存在不良影響，從而導致了裂解組活細胞數及比例均較非裂解組低;CCK-8細胞增殖實驗結果顯示第2代細胞接種7d后，裂解組細胞增殖能力顯著低于非裂解組，提示對于氯化銨裂解處理存活下來的脂肪干細胞，到第2代其生長增殖能力仍然受到不可逆影響。氨的神經毒性已經被廣泛研究，被認為是肝性腦病的最關鍵原因，其毒性作用包括直接毒性、氧化應激、谷氨酰胺水平變化導致能量代謝障礙等[19]。WANG等[20]在體外應用氯化銨處理模擬高氨血癥培養肝細胞，發現氯化銨抑制肝細胞生長、誘導細胞凋亡、造成線粒體通透性轉換孔(mPTP)長時間開放引起線粒體腫脹損傷，并影響細胞三羧酸循環能量代謝造成ATP產生降低等，表明其對肝細胞亦存在細胞毒性。LI等[21]分別應用155mmol/L氯化銨及0.3%低滲氯化鈉提取出的第4代人脂肪間充質干細胞生物學特性進行研究，發現155mmol/L氯化銨裂解組提取出的人脂肪間充質干細胞增殖能力明顯低于0.3%低滲氯化鈉。盡管不同細胞品系對氯化銨毒性反應有所不同[22]，通過該研究初步實驗結果，有理由推測氯化銨裂解步驟可能通過同樣機制影響脂肪干細胞的活性及增殖能力，確切的機制有待進行深入研究。
該研究還發現脂肪干細胞表型和分化能力在裂解組和非裂解組中并無差異，這與LI等[21]的實驗結果一致。學者們對裂解法提取骨髓或臍血來源干細胞進行了諸多研究，多不影響細胞表型。研究表明，紅細胞裂解法制備骨髓間充質干細胞不影響細胞表型及成脂成骨分化能力，且較密度離心法更易于標準化[15]。最近有作者分析了滲透篩選是否可用于從臍血中提取人間充質干細胞，結果證明了間充質干細胞可用此方法進行篩選而不影響細胞表型[23]。此外，在脂肪干細胞成脂及成骨分化方面，裂解組雖然顯示了較低的分化水平，但兩組之間差異無顯著性意義，作者推測短時間內裂解液對細胞膜的影響尚未引起分化相關基因及蛋白的表達，其機制仍有待于進一步探討。
該研究比較了氯化銨紅細胞裂解液法和非裂解法提取的脂肪干細胞的生物學特性的差異，并提供了令人信服的證據說明后者可能是一種更有效的方法，其可以更有效地獲取人脂肪干細胞，更好地保留細胞增殖能力，并不影響細胞表型及細胞成脂、成骨分化能力。目前，非裂解法獲取人脂肪間充質干細胞更有利于臨床應用，對細胞活力及增殖能力影響更低的新型紅細胞裂解液有待研發。
SCISSCIAHCI
