發(fā)布時(shí)間：2020-01-04所屬分類：醫(yī)學(xué)職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要:建立了同時(shí)測(cè)定大鼠毛發(fā)中胱氨酸、酪氨酸和組氨酸的高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)方法。優(yōu)化了色譜分離及檢測(cè)條件，樣品經(jīng)酸解后進(jìn)樣分析。采用TitankC18色譜柱(4.6mm250mm，5m)，以10mmol/L磷酸氫二銨緩沖液(含10mmol/L1-辛烷磺酸鈉，用磷酸調(diào)至pH2.0)-乙腈
摘要:建立了同時(shí)測(cè)定大鼠毛發(fā)中胱氨酸、酪氨酸和組氨酸的高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)方法。優(yōu)化了色譜分離及檢測(cè)條件，樣品經(jīng)酸解后進(jìn)樣分析。采用TitankC18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，以10mmol/L磷酸氫二銨緩沖液(含10mmol/L1-辛烷磺酸鈉，用磷酸調(diào)至pH2.0)-乙腈為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)205nm，進(jìn)樣體積為100μL，柱溫為8℃。結(jié)果表明，在優(yōu)化條件下，大鼠毛發(fā)中的胱氨酸、酪氨酸和組氨酸能實(shí)現(xiàn)有效分離。3種氨基酸的線性良好，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999;檢出限(S/N=3)為49～442μg/L;定量下限(S/N=10)為148～884μg/L;樣品的平均加標(biāo)回收率為97.8%～102%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.1%～1.6%。該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好，可用于大鼠毛發(fā)中胱氨酸、酪氨酸和組氨酸的檢測(cè)。
關(guān)鍵詞:大鼠毛發(fā);胱氨酸;酪氨酸;組氨酸;高效液相色譜(HPLC)
毛發(fā)的主要成分為角蛋白，經(jīng)水解后可得到游離的氨基酸。與血液、尿液等其它生物檢材相比，毛發(fā)具有易于收集、無(wú)損機(jī)體、樣品穩(wěn)定、處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[1]，可作為病因輔助診斷的生物檢材，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。已有研究證明，某些疾病與毛發(fā)蛋白中氨基酸組成的改變密切相關(guān)[2-4]。Min等[3]研究發(fā)現(xiàn)人發(fā)可作為診斷糖尿病的非侵入性生物樣本。缺硫脆發(fā)病患者頭發(fā)的含硫氨基酸(胱氨酸或蛋氨酸)含量較正常人低[5-6]。Lynch等[7]發(fā)現(xiàn)患脫發(fā)綜合癥的澳洲海豹毛發(fā)中的酪氨酸和鋅的濃度比正常健康的海豹明顯降低。Geetha研究小組[8]發(fā)現(xiàn)自閉癥兒童頭發(fā)和指甲蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基的硝化程度與自閉癥的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。Strnad等[9]的研究表明頭發(fā)角蛋白中過(guò)量的組氨酸與基因突變導(dǎo)致的疾病有關(guān)。
相關(guān)期刊推薦：《分析測(cè)試學(xué)報(bào)》(月刊)創(chuàng)刊于1982年，由中國(guó)廣州分析測(cè)試中心、中國(guó)分析測(cè)試協(xié)會(huì)主辦。本刊的宗旨是刊登質(zhì)譜學(xué)、光譜學(xué)、色譜學(xué)、波譜學(xué)、電子顯微學(xué)及電化學(xué)等方面的分析測(cè)試新理論、新方法、新技術(shù)及其在各領(lǐng)域中的應(yīng)用研究成果，反映國(guó)內(nèi)外分析測(cè)試的進(jìn)展和動(dòng)態(tài)，供從事分析測(cè)試和分析化學(xué)研究的科技人員、大專院校師生和管理人員閱讀。有想投稿的，可以咨詢期刊天空在線編輯。
由于毛發(fā)角蛋白中的胱氨酸、酪氨酸和組氨酸均與疾病相關(guān)，因此開(kāi)發(fā)毛發(fā)角蛋白中胱氨酸、酪氨酸和組氨酸的分析方法具有重要意義。目前關(guān)于毛發(fā)角蛋白中氨基酸的檢測(cè)方法主要包括經(jīng)TMS(三甲基硅基團(tuán))衍生化/氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[2，10-11]、衍生化/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-ESI-MS/MS)[4]、柱前衍生化/高效液相色譜法(HPLC)[12]等。但上述方法存在衍生試劑昂貴、衍生步驟繁瑣、耗時(shí)及需要昂貴的特殊儀器等不足，從而限制了其廣泛使用。在反相高效液相色譜中應(yīng)用離子對(duì)試劑分離親水性物質(zhì)已有一定的研究基礎(chǔ)[13-17]。由于游離氨基酸的可離子化性質(zhì)，可通過(guò)在流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑增強(qiáng)氨基酸離子化合物在色譜柱上的保留，從而改善分離效果[18-19]。
本文建立了無(wú)需柱前衍生的同時(shí)直接測(cè)定大鼠毛發(fā)中胱氨酸、酪氨酸和組氨酸的離子對(duì)反相高效液相色譜法。該方法簡(jiǎn)便快捷、穩(wěn)定可靠、專屬性強(qiáng)，可為毛發(fā)在臨床疾病輔助診斷中的應(yīng)用提供參考。
1實(shí)驗(yàn)部分
1.1儀器與試劑
美國(guó)Waters高效液相色譜儀(含PDA檢測(cè)器，Breeze2色譜工作站);AT-950型色譜柱溫箱(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);日本島津AUW220D型電子天平;Milli-Q超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)。
胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.0%)、組氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度100.0%)，上海麥克林生化科技有限公司;酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、辛烷磺酸鈉(純度均為99.0%，薩恩化學(xué)技術(shù)上海有限公司);乙腈(色譜純，Tedia公司);磷酸氫二銨、磷酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水(電阻率為18.2MΩ·cm，25℃)。
大鼠毛發(fā)樣品:由南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，共9例。
1.2色譜條件
色譜柱:TitankC18(4.6mm×250mm×5μm，廣州菲羅門(mén)科學(xué)儀器有限公司)。流動(dòng)相:A為10mmol/L磷酸氫二銨(含10mmol/L1-辛烷磺酸鈉，用磷酸調(diào)至pH2.0)，B為乙腈;梯度洗脫程序:0～5min，95%A;5～6min，95%～86%A;6～15min，86%A;15～16min，86%～87%A;16～34min，87%A;34～35min，87%～50%A;35～40min，50%A;40～41min，50%～95%A;41～48min，95%A。流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為205nm，進(jìn)樣量為100μL，柱溫為8℃。
1.3實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制精密稱取胱氨酸、組氨酸和酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品各10mg，分別置于10mL容量瓶中，加0.1mol/L鹽酸溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度均為1000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。臨用時(shí)，以水逐級(jí)稀釋至所需質(zhì)量濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。
1.3.2標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:精密稱取胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品125mg、組氨酸標(biāo)準(zhǔn)品15mg和酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品50mg，置于250mL容量瓶中，用0.1mol/L鹽酸溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得胱氨酸、組氨酸、酪氨酸質(zhì)量濃度分別約為500、60、200mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。
混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:準(zhǔn)確量取上述混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0.5、2.5、5.0、7.5mL，分別置于10mL容量瓶中，加0.1mol/L鹽酸稀釋至刻度，搖勻，制得混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液Ⅰ(胱氨酸25mg/L、組氨酸3mg/L、酪氨酸10mg/L)、Ⅱ(胱氨酸125mg/L、組氨酸15mg/L、酪氨酸50mg/L)、Ⅲ(胱氨酸250mg/L、組氨酸30mg/L、酪氨酸100mg/L)、Ⅳ(胱氨酸375mg/L、組氨酸45mg/L、酪氨酸150mg/L)，混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液作為混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液Ⅴ(胱氨酸500mg/L、組氨酸60mg/L、酪氨酸200mg/L)。
1.3.3樣品處理取大鼠毛發(fā)若干，用1%的洗潔精超聲振蕩10min，重復(fù)洗滌3次。用超純水將毛發(fā)樣品上的洗潔精漂洗干凈，置于減壓干燥器中干燥，然后用剪刀剪碎(約2mm)。
精密稱取洗凈的毛發(fā)樣品100mg，置于20mL不銹鋼水熱合成反應(yīng)釜中，加入6mol/L的鹽酸8mL，110℃水解16h[20]，取水解液2mL，用20mol/L氫氧化鈉調(diào)至pH2.0后，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾至10mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。
1.3.4測(cè)定精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ與供試品溶液各100μL進(jìn)行液相色譜分析，分別以胱氨酸、組氨酸和酪氨酸的質(zhì)量濃度(x，mg/L)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法以峰面積計(jì)算供試品中胱氨酸、組氨酸和酪氨酸的濃度。
2結(jié)果與討論
2.1色譜條件的優(yōu)化
2.1.1色譜柱的選擇胱氨酸、組氨酸和酪氨酸為親水性物質(zhì)，在HPLC的梯度洗脫中，通過(guò)增加水相的比例可以延長(zhǎng)分析物在色譜柱中的保留時(shí)間。但普通的C18柱不能耐受100%的水溶液，因此本方法選用可在100%水溶液條件下穩(wěn)定使用的TitankC18(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱，其耐受的pH值范圍為1.0～12.0。
2.1.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇采用二極管陣列檢測(cè)器全波長(zhǎng)掃描模式，在190～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)分別對(duì)胱氨酸、組氨酸和酪氨酸進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)胱氨酸在紫外區(qū)只有末端吸收，組氨酸在212nm處有最大吸收峰，酪氨酸在223、276nm處有最大吸收峰。為降低乙腈在低波長(zhǎng)的干擾，同時(shí)考慮到PDA檢測(cè)器響應(yīng)值，最終采用205nm波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定。
2.1.3流動(dòng)相及其pH值的確定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)目標(biāo)分析物在4min前全部出峰;在流動(dòng)相中加入10mmol/L磷酸氫二銨和10mmol/L離子對(duì)試劑1-辛烷磺酸鈉后，目標(biāo)分析物的保留時(shí)間延長(zhǎng)，分離效果得到明顯改善，因此選擇流動(dòng)相A為10mmol/L磷酸氫二銨溶液(含10mmol/L1-辛烷磺酸鈉)，B為乙腈。
對(duì)流動(dòng)相A的pH值進(jìn)行優(yōu)化，用磷酸調(diào)節(jié)其pH值為1.5～3.0，對(duì)供試品溶液進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，流動(dòng)相A的pH值會(huì)影響目標(biāo)分析物的分離效果，當(dāng)pH值為2.0時(shí)，胱氨酸、組氨酸和酪氨酸的分離效果最好。因此確定洗脫液A的pH值為2.0。
2.1.4流速的確定考察了流速(0.9、1.0、1.1mL/min)對(duì)樣品中目標(biāo)分析物分離效果的影響。結(jié)果顯示，隨著流速的增加，目標(biāo)分析物的出峰時(shí)間顯著縮短，綜合考慮分離效果及分析時(shí)間，選擇最佳流速為1.0mL/min。
在最佳色譜條件下，胱氨酸、組氨酸和酪氨酸均能夠完全分離，其標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見(jiàn)圖1A。
2.2方法學(xué)驗(yàn)證
2.2.1工作曲線、檢出限與定量下限分別精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ，按照“1.2”色譜條件進(jìn)行測(cè)定。分別以胱氨酸、組氨酸和酪氨酸的質(zhì)量濃度(x，mg/L)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，胱氨酸、組氨酸和酪氨酸的線性范圍分別為25～500mg/L、3～60mg/L和10～200mg/L，相關(guān)系數(shù)分別為0.9999、0.9996和0.9999(表1)。
分別將胱氨酸、組氨酸和酪氨酸的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1000mg/L)稀釋成一系列的質(zhì)量濃度，按照“1.2”色譜條件依次進(jìn)樣，以信噪比(S/N)為10考察其定量下限(LOQ)，得三者的定量下限分別為330、148、884μg/L;以S/N=3考察其檢出限(LOD)，得三者的檢出限分別為110、49、442μg/L。本方法具有良好的線性范圍和靈敏度，適用于大鼠毛發(fā)中胱氨酸、組氨酸和酪氨酸的定量檢測(cè)。
2.2.2重復(fù)性與穩(wěn)定性
取同一批大鼠毛發(fā)樣品，按“1.3.3”方法平行制備6份供試品溶液。采用“1.2”色譜條件測(cè)定，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法分別計(jì)算大鼠毛發(fā)樣品中胱氨酸、組氨酸和酪氨酸的含量。結(jié)果表明，上述3種氨基酸的平均含量分別為118.6、13.1、33.0mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.2%、0.3%和0.6%，表明本方法的重復(fù)性良好。取同一批大鼠毛發(fā)樣品，按“1.3.3”方法制備供試品溶液，分別在放置0、2、4、8、12、16、20、24h后，按照“1.2”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，胱氨酸、組氨酸和酪氨酸峰面積的RSD分別為0.5%、0.6%和0.6%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.2.3加標(biāo)回收率按“1.3.3”方法制備供試品溶液9份，平分為3組，每組分別添加3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，然后用水定容至刻度，搖勻。按照“1.2”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，每個(gè)水平平行測(cè)定6次。結(jié)果表明，在不同加標(biāo)水平下胱氨酸、組氨酸和酪氨酸的平均回收率為97.8%～102%，RSD為0.1%～1.6%(表2)，表明本方法準(zhǔn)確度高、精密度好，能夠滿足大鼠毛發(fā)中胱氨酸、組氨酸和酪氨酸的測(cè)定要求。
2.3實(shí)際樣品的測(cè)定
采用本文建立的方法，隨機(jī)選取8只大鼠進(jìn)行檢測(cè)。以標(biāo)準(zhǔn)曲線法將峰面積代入回歸方程，計(jì)算大鼠毛發(fā)中胱氨酸、組氨酸和酪氨酸的含量，圖1B為1#樣品的色譜圖。測(cè)得樣品中胱氨酸的含量為105.5～124.6mg/g，組氨酸的含量為12.9～16.3mg/g，酪氨酸的含量為33.4～44.8mg/g(表3)。實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果表明，該法可用于大鼠毛發(fā)中上述3種氨基酸的同時(shí)分析。
3結(jié)論
本文建立了直接同時(shí)檢測(cè)大鼠毛發(fā)中胱氨酸、組氨酸和酪氨酸的HPLC分析方法。該方法簡(jiǎn)便快捷，結(jié)果準(zhǔn)確，且避免了復(fù)雜的衍生化操作以及昂貴儀器的使用，具有較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，有望為毛發(fā)在疾病輔助診斷方面的應(yīng)用提供技術(shù)支持。
