發布時間：2019-12-02所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要背景：干細胞因其可向神經元樣細胞誘導分化而在臨床神經損傷疾病治療中具有廣闊的前景，但干細胞向神經元樣細胞誘導分化的效率不高，為此作者對傳統的誘導方法進行了改良。目的：探討 2 種不同方法誘導人臍帶間充質干細胞向神經元樣細胞分化的潛能及 2
摘要背景：干細胞因其可向神經元樣細胞誘導分化而在臨床神經損傷疾病治療中具有廣闊的前景，但干細胞向神經元樣細胞誘導分化的效率不高，為此作者對傳統的誘導方法進行了改良。目的：探討 2 種不同方法誘導人臍帶間充質干細胞向神經元樣細胞分化的潛能及 2 種誘導方法的優劣。方法：采用組織塊法分離培養人臍帶間充質干細胞，顯微鏡下觀察其形態并利用流式細胞儀進行干細胞鑒定，在神經營養因子誘導方案下，采用相同的誘導劑(2% B27、20 μg/L 堿性成纖維細胞生長因子、20 μg/L 表皮生長因子)，2 種不同的誘導方法將其向神經元樣細胞誘導分化(傳統方法：將 B27、堿性成纖維細胞生長因子、表皮生長因子及青鏈霉素合劑加入 DMEM/F12 培養基中進行誘導，3 d 后加入全反式維甲酸，共培養 10 d;改良方法：將 B27、堿性成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、青鏈霉素合劑及胎牛血清加入 DMEM/F12 培養基中進行誘導，6 d 后用胰酶消化后重新接種于共聚焦小皿內，次日去除 B27 和胎牛血清，并加入全反式維甲酸，共培養 14 d)。應用免疫熒光染色對誘導分化后細胞表面神經標志物——神經絲蛋白(NF-M)和膠質纖維酸性蛋白(GFAP)進行檢測，比較 2 種方法誘導后細胞表面神經標志物的陽性表達率。結果與結論：①成功分離出人臍帶間充質干細胞，經流式細胞儀鑒定其高表達 CD29、CD105，低表達 CD34、 CD45，符合干細胞特性;②2 種方法誘導后，鏡下觀察到的細胞均可呈現神經細胞樣改變，免疫熒光檢測提示 2 種方法誘導后細胞中神經絲蛋白與膠質纖維酸性蛋白均呈陽性表達;③傳統方法組神經絲蛋白與膠質纖維酸性蛋白的陽性率分別為 18.73%和 18.01%，改良方法組二者的陽性率分別為 27.48%和 29.24%，兩組比較差異有顯著性意義(P < 0.05);④結果表明，2 種誘導方法均可將人臍帶間充質干細胞誘導分化為神經元樣細胞;但在誘導分化后的細胞形態、神經標志物(神經絲蛋白與膠質纖維酸性蛋白)的陽性表達率方面，改良方法更具有優勢。
關鍵詞：人臍帶間充質干細胞;誘導分化;神經細胞;神經絲蛋白;膠質纖維酸性蛋白;干細胞
0 引言 Introduction
間充質干細胞是來源于中胚層的非造血干細胞，其具有強大的自我更新、多向分化與免疫調節能力，已成為一種理想的種子細胞，并得到廣泛應用[1-4]。間充質干細胞廣泛存在于身體的各種組織，易于分離和體外擴增，已能在骨髓、滑膜、羊膜、臍帶、胎盤、臍血、脂肪、肺臟、肝臟等組織中被提取出[5-6]。目前已有研究證實人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells， HUMSCs)能夠分化為生殖細胞[7]、汗腺細胞[8]、前列腺樣上皮細胞[9]、心肌細胞[10]、視網膜前體細胞[11]、肝細胞[12]、胰島素分泌細胞[13]、內皮細胞[14]、神經組織[15]、軟骨組織等多種細胞和組織[16]。HUMSCs的培養具有取材方便、不違背倫理道德和法律要求等優點[17]。此外，還有研究表明臍帶中干細胞的含量較骨髓高，故HUMSCs被廣泛認可為替代骨髓間充質干細胞的最理想來源[18]。目前，將HUMSCs 誘導分化為神經元樣細胞，在治療神經退行性疾病、神經損傷、腦卒中等神經系統疾病中都取得了進展[19-22]。
課題組前期實驗采用了神經營養因子誘導法對 HUMSCs向神經元樣細胞誘導分化進行了初探，應用含2% B27、20 μg/L堿性成纖維細胞生長因子、20 μg/L表皮生長因子的DMEM/F12培養基對HUMSCs進行誘導，免疫熒光檢測其表達神經干細胞特異性標志蛋白nestin[23]。前期實驗中作者發現HUMSCs向神經元樣細胞誘導分化的效率較低，為了探索一種安全、高效的誘導方法以滿足以后科研及臨床的需要，作者對前期的誘導方法進行了改良，采用相同的誘導劑，對部分誘導劑的添加時間以及應用時間進行了調整，取得了一定的成效。另外，前期實驗僅檢測了nestin蛋白，為進一步明確誘導HUMSCs分化后的細胞是否為更加成熟的神經元細胞，作者在此次實驗中選用了常用的神經標志物—神經絲蛋白(neurofilament protein， NF-M)和膠質纖維酸性蛋白(glial fiber acidic protein， GFAP)作為檢測指標，旨在探索一種更高效的誘導分化方法，并對HUMSCs向神經元樣細胞分化的潛能進行初步探討。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 設計 細胞學體外觀察實驗。
1.2 時間及地點 實驗于2014年5月至2015年6月在新疆醫科大學第一附屬醫院干細胞室及分子生物實驗室完成。
1.3 材料
1.3.1 臍帶 由新疆醫科大學第五附屬醫院產科獲得足月分娩的健康新生兒臍帶，經醫院倫理委員會審查通過，經產婦及家屬同意并簽署知情同意書，將其放入裝有無菌生理鹽水的50 mL離心管內，4 h內處理。
1.3.2 實驗設備 倒置熒光顯微鏡、Leica Logo型熒光顯微鏡及成像系統(德國Leica公司);流式細胞儀(美國 Beckman公司);含有體積分數為5%CO2培養箱(HF420) (力新儀器上海有限公司)。
1.3.3 實驗試劑 0.25%胰蛋白酶溶液和胎牛血清 (Hyclone公司);青鏈霉素合劑(Sigma公司);FITC標記的抗人CD105、CD29、CD45和CD34抗體(BD公司);表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子(PeproTech公司); B27、DMEM/F12(Gibco公司);小鼠抗NF-M多克隆抗體 (H，M，R)(Cell Signaling公司);小鼠抗GFAP多克隆抗體 (BD公司);山羊抗小鼠IgG二抗(Alexa Flour 488)(Abcam 公司);40 g/L多聚甲醛(上海生工公司);Hoechst33342、 TritonX-100、全反式維甲酸(Sigma公司);體積分數為10% 山羊血清(GIBCO公司)。
1.4 實驗方法
1.4.1 HUMSCs的分離培養 采集足月分娩的健康胎兒臍帶，用0.1 mol/L PBS充分沖洗，去掉殘留血液。采用組織塊法培養[23]：剔除臍帶內動靜脈血管(1根臍靜脈，2根臍動脈)，將剩余間質剪成大小約1 mm3 的組織塊，均勻地放置在盛有DMEM培養基的培養皿(55 mm)中，然后加入2 mL 胎牛血清固定組織塊。2 h后，按比例將含有青鏈霉素、維生素C、谷氨酰胺及碳酸氫鈉的試劑約8 mL加入低糖 DMEM培養基內，放置于37 ℃，體積分數為5%CO2培養箱中進行培養。間隔3 d給予半量換液，鏡下觀察貼壁組織塊周圍的細胞生長情況。當細胞生長達到80%-90%匯合度時，采用0.25%胰酶消化并傳代，將組織塊移至另一個新的培養皿中，按照上述方法繼續進行培養。
1.4.2 流式細胞儀檢測細胞表面分子標志物 收集第3代 HUMSCs，經胰酶消化后離心(1 200 r/min×5 min)使細胞重懸，調整細胞濃度為1×106 L-1，分別加入各種流式抗體： CD105、CD29、CD34、CD45等，常溫下孵育30 min， 0.1 mol/L PBS沖洗數次后，將其與FITC標記(或PE)的二抗在避光條件下作用30 min，PBS充分洗滌后立即送檢。
1.4.3 HUMSCs誘導分化為神經元樣細胞 取第3代 HUMSCs，以4 000/cm2 接種在直徑為3 cm的小皿內。按如下2種方法進行HUMSCs向神經元樣細胞的誘導分化。 ①誘導法一(前期實驗的誘導方法)：將2% B27、20 μg/L 堿性成纖維細胞生長因子、20 μg/L表皮生長因子及青鏈霉素合劑加入DMEM/F12培養基中進行誘導，3 d后加入 0.5 μmol/L全反式維甲酸，隔日換液，10 d后在光學顯微鏡下觀察誘導分化后的細胞形態;②誘導法二(改良的誘導方法)：將2% B27、20 μg/L堿性成纖維細胞生長因子、20 μg/L 表皮生長因子、青鏈霉素合劑及體積分數為2%胎牛血清加入DMEM/F12培養基中進行誘導，6 d后用胰酶消化，以 4 000/cm2 傳代，接種于直徑為3 cm的共聚焦小皿內，次日用0.1 mol/L PBS清洗去除小皿內2% B27和胎牛血清，并加入濃度為0.5 μmol/L全反式維甲酸，隔日半量換液1次， 14 d后在光學顯微鏡下觀察誘導分化后的細胞形態。
1.5 主要觀察指標 誘導分化后免疫熒光染色檢測 NF-M、GFAP的表達：使用40 g/L多聚甲醛對誘導分化后的細胞予以固定，山羊血清封閉，分別加入NF-M抗體 (1∶500)和GFAP抗體(1∶500)并在4 ℃下孵育過夜， 0.1 mol/L PBS洗滌后加入山羊抗鼠二抗(1∶100)于室溫孵育60 min，0.1 mol/L PBS洗滌后Hoechst3342(0.5 mg/L) 復染細胞核，Leica倒置熒光顯微鏡觀察，應用共聚焦顯微鏡進行拍照。重復實驗至少3次以上，每次分別采集共聚焦圖片15張(放大250倍)，采用Image-Pro Plus6.0圖像處理分析軟件分別計算2種方法誘導后的陽性細胞百分數，以計量資料形式表示。2種方法分別設陰性對照(未加入NF-M及 GFAP)，應用免疫熒光法檢測其細胞標志物NF-M、GFAP 的表達。
1.6 統計學分析 應用SPSS 17.0軟件進行統計分析，因資料不符合正態性，故采用秩和檢驗，檢驗水準α=0.05， P < 0.05為差異有顯著性意義。
2 結果 Results
2.1 HUMSCs形態 原代培養第3天，倒置熒光顯微鏡觀察可見組織塊外周有散在的細胞游出。培養第5-7天，大量細胞由組織塊中爬出，貼在皿底，呈長梭狀，類似于成纖維細胞，匯聚后細胞排列緊密，呈群落樣生長，聚合的細胞呈漩渦狀。組織塊法培養原代細胞達90%-95%融合的時間為14-16 d，可進行傳代培養，見圖1。傳代數小時后 HUMSCs快速貼壁，3-5 d后細胞可再次達到80%-90%的匯合度。經過數代培養后，細胞形狀無明顯變化，增殖能力無明顯變化。
2.2 HUMSCs表型鑒定結果 流式細胞儀檢測結果顯示 CD34、CD45表達為陰性，而CD29和CD105表達為陽性(陽性率分別為35.3%和95.9%)，符合HUMSCs的特征性標記物表達，見圖2，提示組織塊法培養可獲得HUMSCs。
2.3 誘導HUMSCs分化為神經元樣細胞 HUMSCs通過 2種方法誘導后均可分化成為神經元樣細胞，部分細胞形態發生變化、胞體收縮形成突起呈星形，細胞之間網狀連接，形態與神經元或神經膠質細胞近似。細胞生長狀態良好，可存活時間較長，改良方案誘導分化后的細胞形態學變化尤為明顯，細胞之間相互聯系的神經微絲結構明顯增多，明顯優于前期實驗的誘導方法，見圖3。
2.4 免疫熒光染色檢測誘導分化后細胞NF-M、GFAP的表達 免疫熒光染色提示HUMSCs用2種方法誘導后均可見 NF-M和GFAP呈陽性表達，表明誘導分化后的細胞具有神經細胞的功能活性，見圖4，5。
2.5 免疫熒光定量NF-M與GFAP陽性表達 傳統方法組 NF-M和GFAP的陽性表達率分別為18.73%和18.01%;改良方法組NF-M和GFAP的陽性表達率分別為27.48%和 29.24%，后者明顯優于前者，差異有顯著性意義(P < 0.05)，見表1。
3 討論 Discussion
HUMSCs最早由McElreavey等[24]于1991年在臍帶華爾通氏膠的黏液結締組織中分離獲得，因其培養取材方便、免疫原性低，并且在體外有較強的自我增殖與多向分化潛能等特點，已經成為種子細胞的理想來源，其在細胞移植、組織工程材料、基因靶向治療等方面具有廣泛的臨床應用價值[17]。
間充質干細胞的分離方法有貼壁培養法、胰酶或膠原酶消化法、免疫磁珠法、流式細胞儀分選法、密度梯度離心法等多種，但目前尚無一種完美的方法，通常需要多種方法結合起來。課題組前期采用組織塊法和胰酶冷消化法體外培養HUMSCs進行實驗研究，結果表明組織塊法培養出的HUMSCs形態保持良好的長梭形，而且增殖率快，可作為獲取充足數量干細胞的理想培養方法[23]。考慮到胰酶或膠原酶消化法容易對細胞造成損傷，流式細胞儀分選法成本高、操作復雜、實驗條件要求高，此次研究中HUMSCs 的培養仍采用成本低廉、操作簡單、對細胞損傷小的組織塊貼壁培養法。該研究對組織塊法分離培養的HUMSCs表面標志物進行流式細胞儀檢測，結果表明CD29、CD105高表達(分別為35.3%和95.9%，且CD105表達大于95%)，而 CD34、CD45低表達，故其具有干細胞的顯著特征;課題組前期實驗將HUMSCs培養傳代數次后觀察其仍具有很強的增殖能力，并通過EdU標記證實其具有增殖功能活性[25]，這與既往報道的骨髓間充質干細胞、脂肪間充質干細胞及胎盤間充質干細胞的生物學特性相似[26-28]。
近年來，間充質干細胞在骨、軟骨、脊髓損傷及多發性硬化、克羅恩病等疾病的臨床研究中愈來愈受重視[29]，目前HUMSCs已用于臨床2型糖尿病[30]、重度收縮性心力衰竭等疾病的治療[31]。干細胞對神經系統損傷和修復一直是臨床關注的焦點[19-22]，研究發現間充質干細胞能分泌多種免疫調節因子和神經營養因子，可促進受損部位的神經再生，安全有效地改善了神經系統疾病的預后，其臨床療效已在腦癱、帕金森病、脊髓變性疾病、腦血管疾病等臨床試驗中得到驗證[32]。目前認為HUMSCs修復外周神經系統受損的關鍵機制為其旁分泌作用[33]，也有學者認為 HUMSCs可以通過白細胞介素8介導的分泌機制促進受損的神經功能恢復[34]。
當前，體外誘導HUMSCs向神經元樣細胞分化的方式包括化學法、中藥、神經營養因子法、共培養法，還有學者利用腦脊液等進行誘導分化的方法[35]。化學因子誘導的細胞存活時間短[36]，且其誘導的神經元樣細胞的特征性形態學變化表明其具有細胞毒性作用，可能不適用體內移植。中藥可誘導HUMSCs分化為神經元樣細胞，但是中藥發揮誘導分化的作用機制尚需更近一步研究。而神經營養因子誘導劑為生物制劑，對細胞損傷小，安全性相對較高，為目前廣泛應用的經典誘導方法。
基于前期HUMSCs培養及其生物學特性觀察的實驗研究基礎[23，25]，該實驗采用同樣的誘導劑，2種不同的誘導方法將HUMSCs向神經元樣細胞誘導分化，并對2種誘導方法進行了評價和比較。作者經過多次重復實驗證實了2 種方法誘導后細胞的形態均呈神經細胞樣改變，免疫熒光化學檢測NF-M及GFAP均呈陽性表達，同時，在進行NF-M 及GFAP免疫熒光染色時分別設置了PBS陰性對照組，除外免疫熒光假陽性的可能，故實驗證實了HUMSCs具有向神經元樣細胞分化的潛能。通過鏡下觀察及統計學分析發現改良方法的細胞形態改變及神經細胞標志物(NF-M和 GFAP)的陽性率明顯優于傳統方法，故改良方法是對前期誘導方法的有效改良。此結論可為后續HUMSCs向神經元樣細胞誘導分化提供理論支持。
該實驗2種誘導方法的主要不同之處在于改良方法的試劑中含有體積分數為2%的胎牛血清以及2種誘導法應用 B27的時間長短不同。改良方法中體積分數為2%的胎牛血清在實驗早期有助于促進細胞貼壁生長，為HUMSCs向神經元樣細胞分化提供了充足的營養物質，在7 d后及時去除胎牛血清，B27又可以減緩細胞生長，避免細胞生長過快、濃度過大而影響干細胞向神經元樣細胞分化過程中的形態變化及免疫熒光染色效果。傳統方法的試劑中雖然不含積分數為2%的胎牛血清但含有B27，且在其誘導后期繼續應用B27總共誘導了10 d，其誘導后的細胞生長旺盛，但呈神經細胞樣形態變化的細胞較少，免疫熒光染色中NF-M和 GFAP的陽性表達率也較低。孫麗等[37]采用丹參聯合生長因子誘導HUMSCs向神經元樣細胞分化后的GFAP陽性表達率為(25.6±2.6)%，與此實驗結果類似，但其未檢測 NF-M;郜元軍等[38]比較了膠質細胞神經營養因子聯合胎腸培養基，維甲酸、ZnSO4聯合胎腸培養基誘導大鼠基質干細胞分化為腸神經細胞的效率，2種誘導法NF-M的陽性表達率分別為(75.6±8.4)%和(48.5±7.5)%，而GFAP均為陰性表達。郜元軍實驗中NF-M的陽性率高于此次實驗研究，考慮與兩者的實驗對象、所用的誘導方法及試劑不同有關。此次實驗過程中傳統誘導方法在第10天左右細胞形態最佳，此后出現大量細胞凋亡現象;而改良誘導方法在第14 天左右細胞形態最佳，僅出現少量細胞凋亡現象，所以傳統誘導法的周期設定為10 d，而改良誘導方法為14 d，兩者沒能達到統一的誘導時間。
實驗結果驗證了HUMSCs可分化為神經元樣細胞，作者通過對前期的誘導方法進行改良，明顯提高了HUMSCs 向神經元樣細胞誘導分化的效率，為后續實驗研究提供了有力的保障。但是研究也存在不足之處有待改進，目前常用神經標志物有神經特異性烯醇化酶、NF-M、GFAP、β微管蛋白Ⅲ、微管相關蛋白等。該研究為系列探索性實驗研究，前期實驗檢測了神經干細胞特異性標志蛋白nestin，此次研究僅選用了神經標志物NF-M和GFAP作為檢測指標，說服力仍顯不足，后續研究中課題組還將進一步檢測微管相關蛋白、β微管蛋白Ⅲ等神經標志物以驗證實驗結果。
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