聚集誘導熒光超分子探針在細胞成像中的應用

發布時間：2019-12-02所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次

摘 要： 摘 要：利用 Suzuki 反應制備得到三苯胺三吡啶(TPPA)，通過季銨鹽成鹽反應制備得到超分子熒光探針(TPPA-DBB). 通過核磁質譜儀、紅外光譜儀、紫外-可見光度計、熒光光譜儀、動態光散射測試儀和激光共聚焦顯微鏡等對產物進行表征. 結果表明：TPPA-DBB 超分子熒

　　摘 要：利用 Suzuki 反應制備得到三苯胺三吡啶(TPPA)，通過季銨鹽成鹽反應制備得到超分子熒光探針(TPPA-DBB). 通過核磁質譜儀、紅外光譜儀、紫外-可見光度計、熒光光譜儀、動態光散射測試儀和激光共聚焦顯微鏡等對產物進行表征. 結果表明：TPPA-DBB 超分子熒光探針表現出很好的聚集誘導熒光性質(AIE)和長斯托克位移. 細胞成像結果顯示：TPPA-DBB 超分子熒光探針是一種與 DNA 強力結合的熒光染料，并且具有很好的生物相容性.

　　關鍵詞：聚集誘導熒光;三苯胺;細胞成像;超分子

　　0 引言

　　近年來熒光成像技術作為快速發展的醫學診療技術而受到廣泛的關注，而高質量的細胞成像技術更需要具有生物相容性、亮度、穩定性好的有機外源造影劑[1，2]. 2001 年被發現并迅速發展的聚集誘導發光材料(AIEgens)是優秀的候選材料，因為它們在抑制分子內運動效應時表現出熒光增強的效果. 一旦與生物分子結合或受到周圍生物環境影響，AIEgens 就會被單獨點亮并且可以在高靈敏度熒光成像的基礎上獲取豐富的信息[3-7]. 近年來市面上有一些商品化的細胞核熒光染料，比如 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，它們只會發出藍色熒光[8-11]，這可能會導致細胞損傷顯著的細胞自發熒光，更何況價格昂貴且不穩定[12]. 通過 Suzuki 反應和季銨鹽反應合成了含三苯胺吡啶基團的超分子探針(TPPA-DBB). 通過熒光和紫外光譜的研究，以期其具備作為細胞成像熒光探針光學特質. 同時通過熒光顯微鏡和細胞毒性測試來研究該熒光超分子探針在活體細胞中的成像特征和生物相容性.

　　1 實驗部分

　　1.1 試劑與儀器

　　三碘代三苯胺(分析純，安耐吉化學)，4-吡啶硼酸(分析純，安耐吉化學)，四三苯基磷鈀(分析純，阿拉丁試劑)，1，4-二(溴甲基)苯(分析純，阿拉丁試劑)，碳酸鉀，四氫呋喃，正己烷，石油醚等試劑均為分析純. MERCURY 核磁質譜儀;Nicolet AVATAR 360 TF-IR 紅外光譜儀;日本 UV-2550 紫外-可見分光光度計;美國 PE 公司 LS-55 熒光儀;日本 OLYMPUS FV1200 激光共聚焦顯微鏡;Zetasizer Nano ZS 動態光散射測試儀.

　　1.2 合成

　　1.2.1 三苯胺三吡啶的合成

　　取三碘代三苯胺 311.5 mg(0.5 mmol)溶于 40 mL 無水四氫呋喃中. 取 4-吡啶硼酸 400.5 mg(2.25 mmol)溶于 40 mL 甲醇中并添加 57.8 mg(0.05 mmol)四三苯基磷鈀和 310 mg(2.25 mmol)碳酸鉀于三口瓶中攪拌 0.5 h，完成后將三碘代三苯胺四氫呋喃溶液加入三口瓶中，在氮氣保護下于 120 ℃回流 24 h. 得到的產物三苯胺三吡啶(TPPA)為淡黃色固體.

　　1.2.2 超分子熒光探針的合成

　　將干燥的 TPPA 固體 150 mg(0.31 mmol)溶于 50 mL 無水四氫呋喃中，在不斷攪拌下緩慢滴加對二芐溴 36.75 mg(0.21 mmol). 滴加完成后，通氮氣保護并在 120 ℃條件下回流 2 h. 反應完成后將反應物用刮刀刮下并用甲醇重結晶并反復沖洗浸泡. 最后得到的產物超分子熒光探針(TPPA-DBB)為橙紅色固體. TPPA-DBB 的化學結構如圖 1 所示.

　　1.3 表征與測試

　　1.3.1 紫外光譜測試

　　將配制好的不同濃度的溶液放入超聲波清洗儀中振蕩均勻 0.5 h，并轉入 2 cm 光程的石英比色皿. 待紫外光譜儀穩定后通過波長掃描模式測試最大吸收波長和最大吸收強度.

　　1.3.2 熒光光譜測試

　　將配制好的不同濃度的溶液放入超聲波清洗儀中振蕩均勻 0.5 h，并轉入 2 cm 光程的石英比色皿. 待熒光光譜儀穩定后通過波長掃描模式確定熒光探針的激發波長，并以此激發波長測試最大熒光發射波長及熒光發射強度.

　　1.3.3 DNA 體外識別測試

　　配制 1 g/L 的 TPPA-DBB 溶液，然后分別稱取 0.06～8.00 mg 系列不同質量的DNA 分子溶于 TPPA-DBB 水溶液中，之后將這些溶液放入超聲波清洗機中超聲 10 min 使其混合均勻，待冷卻至室溫后進行熒光光譜的測定.

　　1.3.4 細胞毒性測試

　　選擇 A549 細胞為研究對象，采用 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽 (MTT) 法檢測 TPPA-DBB 的細胞毒性. 將對數期的 A549 細胞種于 96 孔培養板中(接種密度為 1×104 /孔)，放入 37 ℃、5% CO2 條件的培養箱里培養 24 h，然后將含有不同濃度的 TPPA-DBB 溶液分別依次滴加至不同孔中. TPPADBB 的濃度依次為 0，10，20，30，40，50 μM，在 5%CO2、37 ℃的條件下孵育 24 h. 向每個孔中加入 MTT 溶液 10 μL(5 g/L)，再以相同條件繼續孵育 2 h. 最后在每個小孔中加入 100 μL 二甲基亞砜并室溫靜置 2 h. 用熒光免疫分析儀檢測690 nm 處各孔的吸光度，檢測熒光探針的細胞毒性. 最后實驗結果由 7 組實驗平均值和標準偏差得出.

　　1.3.5 細胞成像測試

　　將人肺癌細胞(A549)接種(接種密度為 1×105 /孔)在 15 mm 載玻片上貼壁生長 24 h，然后用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗，然后將濃度為 20 mg/L 的 TPPA-DBB 用二甲基亞砜稀釋并滴加在載玻片中，并繼續孵育10 min，繼而用 PBS 緩沖液洗滌. 最后將制備好的細胞載玻片放置在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察并記錄.

　　2 結果與討論

　　2.1 TPPA-DBB 固體紫外和固體熒光測試

　　取 TPPA-DBB 的固體進行紫外和熒光光譜測試，如圖 2 所示，固體最大紫外吸收峰為 438 nm，固體熒光發射最大波長為 613 nm. 計算 TPPA-DBB 共聚物的斯托克位移為 175 nm. 根據紫外和熒光光譜測試結果可以得出 TPPA-DBB 具有長斯托克位移. 通常具有長斯托克位移的物質具有背景干擾低、樣品穿透性強、檢測靈敏度高等優點.

　　2.2 TPPA-DBB 在甲醇中的紫外光譜

　　選擇 TPPA-DBB 濃度范圍從 1.0 mg/L 到 12.0 mg/L 的甲醇溶液測試紫外可見吸收光譜. 如圖 3 所示，圖中隨著 TPPA-DBB 質量濃度逐漸增大，紫外吸光度也逐漸增大. 從紫外光譜來看紫外吸收峰形沒有發生改變，而且最大吸收峰沒有發生轉移，說明 TPPA-DBB 在甲醇溶液中沒有發生分子間相互作用. 分析表明 TPPA-DBB 在甲醇溶液中具有很好的穩定性.

　　2.3 聚集誘導熒光特性

　　選取溶解性良好的溶劑甲醇和不良好的溶劑水作為混合溶劑體系. 通過檢測 TPPA-DBB 在水和甲醇不同體積比溶液中的熒光光譜，發現 TPPA-DBB 具有聚集誘導熒光特性，如圖 4～圖 6 所示，水的體積分數在 0%～20%范圍時熒光變化并不明顯，而在水的體積分數為 20%～60%的范圍內有明顯的熒光增強現象，水的體積分數在 60%～95%的范圍時雖然熒光強度增加但是增加速率變小. 最終檢驗熒光強度倍數提高，最大熒光強度大約增加 2 倍. 這說明 TPPA-DBB 超分子熒光探針具有聚集誘導熒光特性.

　　2.4 DNA 體外識別

　　測試測試 TPPA-DBB 超分子是否也具有對 DNA 熒光識別作用，首先采取體外實驗的辦法進行確定. 發現 TPPA-DBB 與 DNA 結合后最大熒光發射波長發生了藍移，這說明 TPPA-DBB 可以通過分子間作用力與DNA 分子進行結合，見圖 7 和圖 8. 在 DNA 低濃度范圍(0.06～1.00 mg)內加入 DNA 的質量與熒光發射強度成正比，當加入 DNA 的質量超過 4 mg 時發生飽和.

　　2.5 細胞毒性測試

　　以人體肺腺癌細胞 A549 細胞為實驗對象，分別對不同濃度的 TPPA-DBB 探針做了 MTT 實驗. 如圖 9(a)所示，細胞的存活率隨著 TPPA-DBB 探針濃度的增大而降低，最終細胞的存活度都在 80%以上，表明化合物 TPPA-DBB 的加入對細胞的毒性傷害較小. 在探針的濃度為 10 mg/L 的條件下，細胞存活度與空白對比只有很小的損失，當探針濃度為 20 mg/L 時細胞仍具有 90%以上存活率. 以 10 mg/L 作為工作濃度考察了細胞代際存活率，見圖 9(b)，細胞在培養 5 代時仍有 80%的存活率.

　　2.6 細胞成像測試

　　使用激光共聚焦熒光顯微鏡進行細胞成像的測試，結果如圖 10 所示，通過與 DAPI 做比對實驗觀察， TPPA-DBB 最終停留在細胞核內部并對細胞核進行特定標記. 這說明合成的 TPPA-DBB 超分子熒光探針可以很好地穿越細胞膜進入細胞體內，并且通過細胞核的核孔進入到細胞核內部與 DNA 結合發出明亮的熒光. 在單色激發波長下，可以很明顯地捕捉到熒光探針在細胞核內駐留并且可以發出很強的熒光. 上述結果說明 TPPA-DBB 是一種可以對細胞核染色的高靈敏度的超分子熒光探針.

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　　3 結論

　　通過 Suzuki 偶聯反應和季銨鹽反應制備了具有三苯胺三吡啶基團的超分子熒光探針 TPPA-DBB. TPPA-DBB 超分子在混合溶液中表現出聚集誘導熒光性質，其固體也有很大的斯托克位移. TPPA-DBB 分子穩定性好、易穿透細胞膜、細胞毒性低. 作為超分子熒光探針可以有效地提高自身的電荷密度，大幅度提高與DNA 的相互作用，與傳統的小分子熒光探針相比具有更高的靈敏度和更好的生物相容性. 在細胞成像領域中 TPPA-DBB 可以實現對 A549 活細胞的細胞核進行高靈敏度、高分辨率的成像.