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摘 要： 摘要 為探索寧波舟山港域內(nèi)發(fā)熱伴血小板減少綜合征(SFTS)的發(fā)病率與病死率明顯高于省內(nèi)其他地區(qū)的原因，為今后 SFTS 的檢疫、防控與診治提供科學(xué)依據(jù)。 對(duì)發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(SFTSV)及 4 種類 SFTSV 病毒采用熒光 RT-PCR 及間接免疫熒光法用于疑似病
摘要 為探索寧波舟山港域內(nèi)發(fā)熱伴血小板減少綜合征(SFTS)的發(fā)病率與病死率明顯高于省內(nèi)其他地區(qū)的原因，為今后 SFTS 的檢疫、防控與診治提供科學(xué)依據(jù)。 對(duì)發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(SFTSV)及 4 種類 SFTSV 病毒采用熒光 RT-PCR 及間接免疫熒光法用于疑似病例血清樣本中病毒的檢測(cè)，并對(duì)確認(rèn)陽(yáng)性的樣本進(jìn)行病毒分離、序列測(cè)定與基因進(jìn)化分析。 在蜱、螨、鼠傳播媒介中 SFTSV 及 4 種類 SFTSV 病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，在 180 例疑似病例血樣中僅檢出 SFTSV，陽(yáng)性率為 51.11%(92/180)。 樣本病毒分離陽(yáng)性率為 72.31%(47/65)。 所分離 SFTSV 病毒的序列分析結(jié)果顯示出 A 與 B 兩個(gè)基因型及 5個(gè)進(jìn)化分支，其中 A 型占 25.53%、B 型占 74.47%。 當(dāng)前流行于寧波舟山港域內(nèi)的 SFTSV 病毒僅為 SFTSV 且以 B 基因型為主。 B 型 SFTSV 病毒在國(guó)內(nèi)罕見，在遺傳進(jìn)化上具有相對(duì)獨(dú)立的進(jìn)化特征。
關(guān)鍵詞 寧波舟山港;發(fā)熱伴血小板減少綜合征;相關(guān)病毒監(jiān)測(cè);遺傳特征
發(fā)熱伴血小板減少綜合征 (Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome，SFTS)是由新型布尼亞病毒也稱發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(SFTSV)感染所致的新發(fā)傳染病，SFTSV 廣泛分布于中國(guó)中東部、韓國(guó)與日本[1]。潛伏期一般為 7～14 d，平均 9 d，其發(fā)病特點(diǎn)為發(fā)病急，病情進(jìn)展快，臨床上主要表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力、頭痛、肌肉酸痛、局部淋巴結(jié)腫大、消化道癥狀及血小板及白細(xì)胞減少，轉(zhuǎn)氨酶、肌酸激酶、乳酸脫氫酶升高。 部分病例可出現(xiàn)出血癥狀，少數(shù)重癥病例可因多臟器功能損傷救治無(wú)效而死亡，平均病死率約 10%～30%，在日本韓國(guó)則高達(dá) 50%[2，3] 。2011 年 6月舟山市首例發(fā)熱伴血小板減少綜合征病例被確診[4]，此后每年都有新病例被確診， 發(fā)病人數(shù)與病死率都呈不斷上升趨勢(shì)，另有 30%左右的臨床疑似病例得不到病原學(xué)確診，是否還有與 SFTSV 類似的病毒存在引起了我們的關(guān)注。 當(dāng)前國(guó)際上與 SFTSV 高度相關(guān)的類 SFTSV 病毒有來(lái)自美國(guó)的腹地病毒(Heartland virus，HRTV)、澳大利亞的獵人島病毒(Hunter Island virus，HIGV)、印度的馬爾索爾病毒(Malsoor virus， MalsoorV)及新疆的古爾圖病毒(Guertu virus，GuertuV)[5]，上述 4 種病毒基因結(jié)構(gòu)與 SFTSV 相同，均有 L、M、S 的 3 個(gè)特異性基因節(jié)段，與 SFTSV 的基因序列相似度分別是：61.2%、52.0%、56.4%與 75.2%。 上述 5 種病毒基因編碼的蛋白抗原也有一定得交叉反應(yīng)，除了 SFTSV 與 HRTV 能感染人引起發(fā)熱伴血小板減少綜合征之外其他 3 種病毒未見致病性報(bào)道，但并不代表著這些類 SFTSV 不具有潛在的危險(xiǎn)性[6，7] 。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1.1 疑似病人血清采集與處理
為適當(dāng)擴(kuò)大檢測(cè)范圍，SFTS 疑似病例的確定參照《發(fā)熱伴血小板減少綜合征防治指南(2010 版)附件 2》執(zhí)行。 2014—2017 年共采集臨床 SFTS 疑似病例 180 例，男性 78 例，女性 102 例，年齡分布 12～88 歲，平均 63.31 歲±14.51 歲。 病人入院后采集清晨空腹靜脈血 5 mL， 分離血清后以每管 0.5 mL 分裝后置-80℃超低溫冰箱保存。
實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 特異度驗(yàn)證用的SFTSV 陰性血清由體檢正常的嬰幼兒血清與臨床常見的其他血液病毒陽(yáng)性血清：乙肝 病 毒(HBV)、丙 肝 病毒(HCV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)及登革熱病毒(DENV)組成，SFTSV 陽(yáng)性血清由舟山市婦幼保健院、 舟山醫(yī)院、岱山縣疾病控制中心提供。
1.1.2 傳播媒介采集與處理
1.1.2.1 鼠
在寧波舟山港域內(nèi)每年有發(fā)熱伴血小板減少綜合征病例確診的象山縣、 寧海縣與岱山縣的患者居住地周圍野外山坡地(疫點(diǎn))用鼠籠或鼠夾捕捉老鼠并進(jìn)行鼠種分類登記，在生物安全柜內(nèi)解剖老鼠，取鼠肺保存于-80℃超低溫冰箱， 取 1 g 左右鼠肺樣本到 2 mL EP 管，加 1 mL 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液(MEM)在混合球磨儀(型號(hào) MM400)中低溫研磨 2 次(50 Hz 2 min/次)，然后 8 000 rpm 低溫離心 5 min，取上清 200 μL 提取 RNA，上清為熒光 RT-PCR 檢測(cè)用模板。 余下的 300 μL 保存于-80℃作為復(fù)檢與病毒分離備用樣本。
1.1.2.2 蜱
游離蜱選用布旗法采集野外草地游離未吸血蜱，回實(shí)驗(yàn)室解剖顯微鏡下分類，10 只蜱為一組。
1.1.2.3 螨
游離螨蟲捕捉參照于娟等報(bào)道的小黑板方法[8]，選晴天上午 10 時(shí)至下午 3 時(shí)在患者居住地周圍草地上放小黑板若干塊，10～20 min 取回小黑板，觀察正反面， 如有緩慢爬行的游離螨， 即用濕毛筆挑入 EP 管內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室倒置顯微鏡下鑒定、計(jì)數(shù)、備用。寄生螨選疫區(qū)患皮膚病的貓與狗， 用棉簽刮取貓耳內(nèi)分泌物放入 EP 管內(nèi)或用手術(shù)刀片刮取狗耳皮炎處皮屑放入 EP 管內(nèi)，在實(shí)驗(yàn)室倒置顯微鏡下鑒定、計(jì)數(shù)、分組，按每組 100 只螨樣本放入 2 mL EP 管，用 25%酒精清洗消毒 1 min，加 1 mL MEM 渦旋清洗反復(fù) 3 次，8 000 rpm 5 min 去上清。加 500 μL MEM 在 MM400 混合球磨儀中低溫下進(jìn)行研磨 2 次(50 Hz 2 min/次)，8 000 rpm 低溫離心 5 min 取上清 200 μL 提取 RNA，上清為熒光 RT-PCR 檢測(cè)用模板。 余下 300 μL 保存于-80℃作為復(fù)檢與病毒分離備用樣本。
1.1.3 熒光定量 RT-PCR 的引物與探針設(shè)計(jì)與合成
選用美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)靶基因核苷酸序列搜尋軟件 (Nucleotide)、Blast 比對(duì)分析軟件、美國(guó)綜合 DNA 技術(shù)公司(IDTDNA)網(wǎng)上引物設(shè)計(jì)軟件， 進(jìn)行發(fā)熱伴血小板減少綜合征相關(guān)病毒的引物、探針設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)的引物、探針序列經(jīng) Blast 比對(duì)驗(yàn)證合格的引物、探針，選擇綜合指標(biāo)最優(yōu)的序列提交到 TaKaRa 生物工程公司合成與標(biāo)記，5’標(biāo)記 FAM 或 HEX 發(fā)光基團(tuán)，3’標(biāo)記 TAMARA 或 BHQ1 淬滅基團(tuán)，見表 1。
1.1.4 5 種病毒陽(yáng)性質(zhì)粒構(gòu)建
從 Nucleotide 軟件上分別下載 5 種病毒靶基因序列，經(jīng)與熒光 RT-PCR 匹配的前引物至后引物連續(xù)序列作為 5 種病毒陽(yáng)性質(zhì)粒構(gòu)建序列，經(jīng) Blast 特異度比對(duì)分析合格后， 把上述 5 段陽(yáng)性質(zhì)粒序列提交到 TaKaRa 生物工程公司合構(gòu)建質(zhì)粒。 上述 5 個(gè)陽(yáng)性質(zhì)粒可用于實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 的陽(yáng)性對(duì)照、定量標(biāo)準(zhǔn)參照、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制等。 5 種病毒陽(yáng)性質(zhì)粒序列見表 2。
1.1.5 主要試劑
一步法實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 試劑盒(RR064A)、一步法 RT-PCR 試劑盒(RR055A)、PCR 試劑盒(RR 902A)、RNA 逆轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒(6210A)均購(gòu) 自 寶 生 物工程(大連)有限公司，病毒 RNA 提取試劑盒(德國(guó) QIAGEN 公司 74104)、酶聯(lián)免疫 SFTSV 抗體檢測(cè)試劑盒(無(wú)錫鑫連鑫生物醫(yī)學(xué)科技公司)。
1.2 方法
1.2.1 5 種病毒實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 快速檢測(cè)體系構(gòu)建
熒光 RT-PCR 擴(kuò)增體系與反應(yīng)條件、引物與探針配比與濃度的優(yōu)化， 然后對(duì)建立的熒光 RT-PCR 的靈敏度、特異度、重復(fù)性、擴(kuò)增曲線形態(tài)、反應(yīng)所需時(shí)間等重要指標(biāo)進(jìn)行測(cè)試、比對(duì)與評(píng)估。
1.2.2 病毒載量檢測(cè)體系構(gòu)建
定量標(biāo)準(zhǔn)品制備：根據(jù)寶生物工程(大連)有限公司構(gòu)建提交的 5 種病毒的陽(yáng)性質(zhì)粒濃度數(shù)據(jù)換算成拷貝數(shù)，換算公式：﹙每微升質(zhì)粒質(zhì)量×10-9 /660×質(zhì)粒堿基長(zhǎng)度﹚×6.02×1023 =拷貝數(shù)/μL。 經(jīng)計(jì)算 5 種病毒的陽(yáng)性質(zhì)粒原液的每微升拷貝數(shù)見表 3。
1.2.3 熒光定量 RT-PCR 檢測(cè)陽(yáng)性樣本的鑒定
1.2.3.1 病毒 L、M、S 3 個(gè)特異性基檢測(cè)鑒定
5 種病毒遺傳基因結(jié)構(gòu)相同均含有 L、M、S 3 個(gè)特異性基因， 所有實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 陽(yáng)性樣本須經(jīng) L、M、S 3 個(gè)特異性基因檢測(cè)， 3 個(gè)特異性基因檢測(cè)陽(yáng)性該樣本確認(rèn)為陽(yáng)性。 3 個(gè)特異性基因檢測(cè)方法采用巢式 PCR，引物選用參考文獻(xiàn)[9]中的引物。
1.2.3.2 病毒分離培養(yǎng)鑒定
符合病毒分離的陽(yáng)性樣本(距發(fā)病時(shí)間 5 d 以內(nèi)、 CT 值<35 的血清)用非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，具體步驟按胡逢蛟等[10]報(bào)道的方法執(zhí)行，取樣本 100 μL，加 10 μL 青霉素和鏈霉素，使雙抗終濃度為 1 000 U/mL，4℃放置4 h。 將生長(zhǎng)至 70%～80%的單層 Vero 細(xì)胞用維持液洗滌 3 次后加入雙抗處理過(guò)的血清樣本及 3 mL 細(xì)胞 維 持 液。 置 于 35℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中過(guò)夜，次日棄去液體，并用細(xì)胞維持液洗一遍， 再加入 3 mL 細(xì)胞維持液放置于 35℃、5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 每隔 3 d 換一次液，并逐日觀察細(xì)胞病變 (CPE) 至++++時(shí)取上清作病毒鑒定，無(wú)細(xì)胞病變(CPE)的樣本繼續(xù)培養(yǎng)至第 14 d，陰性樣本盲傳 3 代，第 3 代仍未出現(xiàn) CPE 者進(jìn)行間接熒光免疫法(IFA)與 PCR 檢測(cè)，有陽(yáng)性反應(yīng)的繼續(xù)傳代，無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)的樣本作陰性處理。
1.2.3.3 病毒序列測(cè)定比對(duì)分析及聚類進(jìn)化樹構(gòu)建
選擇具有代表性陽(yáng)性樣本進(jìn)行序列測(cè)定分析及 聚類進(jìn)化樹構(gòu)建 。 運(yùn) 用 MEGA5.2 軟 件 中 的 Clustal W 進(jìn)行序列比對(duì)，基于 Kimura-2 模型構(gòu)建NJ (Neighbor-Joining)系統(tǒng)進(jìn)化樹，并計(jì)算序列之間的遺傳距離。 基因分型參照復(fù)旦大學(xué)付永鋒博士的方法[11]。
1.2.4 實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
實(shí)驗(yàn)樣本采集、檢測(cè)、診斷、病例分類等標(biāo)準(zhǔn)按《發(fā)熱伴血小板減少綜合征防治指南，2010 版》執(zhí)行[12]。 實(shí)驗(yàn)室個(gè)人防護(hù)、實(shí)驗(yàn)廢棄物處置、防護(hù)設(shè)備要求等生物安全措施按 《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》執(zhí)行[13]。 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)參照陳坤主編的《臨床流行病學(xué)》[14]。
1.2.5 倫理學(xué)問(wèn)題
采樣、 檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析專業(yè)工作者應(yīng)對(duì)被調(diào)查者的所有信息及病情進(jìn)行保密。
2 結(jié)果
2.1 5 種病毒實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 與陽(yáng)性質(zhì)粒驗(yàn)證結(jié)果
2.1.1 實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR擴(kuò)增體系與反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果
熒光 RT-PCR 擴(kuò)增體系為 25 μL(064 A)，優(yōu)化后各反應(yīng)物的體積為：RT-PCR 緩沖液 12.5 μL;校正液 (ROX)0.5 μL;Taq 酶和逆轉(zhuǎn)錄酶各 0.5 μL(5 單位/μL);10 μmol/L 上游引物 0.5 μL;10 μmol/L 下游 引 物 0.5 μL;5 μmol/L 熒 光 探 針 0.5 μmol/L (TaqMan);Rnase Free 水 4.5 μL;模板 5 μL。 反應(yīng)條件(FAST)：逆轉(zhuǎn)錄：42.0℃ 5 min、95℃ 10 s ;PCR： 95℃ 1 s、60℃ 20 s，40 個(gè)循環(huán);60℃在 FAM 或 VIC 通道采集熒光信號(hào)。 在上述條件下 HRTV、SFTSV、 HIGV、MalsoorV 與 GuertuV 優(yōu)化后的熒光 RT-PCR 用于以下不同濃度的陽(yáng)性質(zhì)粒檢測(cè)， 檢測(cè)結(jié)果顯示本研究建立的方法均能用于 HRTV、SFTSV、HIGV、 MalsoorV 與 GuertuV 病毒核酸檢測(cè)， 并能獲得有規(guī)律的典型的擴(kuò)增曲線。 HRTV、SFTSV 擴(kuò)增曲線見參考文獻(xiàn)[15]報(bào)道，HIGV、MalsoorV 與 GuertuV 的擴(kuò)增曲線見圖1。
2.1.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)體系的靈敏度測(cè)試結(jié)果
將構(gòu)建的5種病毒陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品從 5×107 拷貝/μL 稀釋至 5×100 拷貝/μL 共 8 個(gè)濃度，用上述熒光 RT-PCR 快速檢測(cè)體系分別測(cè)其定靈敏度，測(cè)定結(jié)果是：SFTSV、MalsoorV、GuertuV 均達(dá) 到 5×100 拷貝/μL，HRTV、HIGV 達(dá)到 5×101 拷貝/μL。
2.1.3 實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 的重復(fù)性測(cè)試結(jié)果
將構(gòu)建的 5 種病毒陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品從 5×107 拷貝/μL 稀釋至 5×101 拷貝/μL 共 7 個(gè)濃度，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)試 3 次，計(jì)算重復(fù)測(cè)試樣本的平均 CT 值、標(biāo)準(zhǔn)差與變異系數(shù)，結(jié)果見表 4。
2.1.4 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的特異度測(cè)試結(jié)果
取臨床常見的血液病毒陽(yáng)性血清、 體檢正常的成人血清、SFTSV 確診陽(yáng)性血清各 30 份，以體檢正常的嬰幼兒混合血清為 5 種病毒陰性對(duì)照， 以 5 種病毒陽(yáng)性質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照。 用上述 5 種實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 分別檢測(cè)驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果：陽(yáng)性對(duì)照均為陽(yáng)性，陰性對(duì)照均為陰性，在 90 份驗(yàn)證血清中未檢測(cè)到 HRTV、HIGV、MalsoorV、GuertuV 4 種病毒，但在 30 份 SFTSV 確診陽(yáng)性血清中均能檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果。
2.2 臨床疑似病例血清中5種病毒監(jiān)測(cè)結(jié)果及陽(yáng)性病人島嶼分布
2014—2017 年共收集臨床疑似病例急性期血清 180 份，用上述實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 檢測(cè)試劑對(duì) 5 種病毒進(jìn)行檢測(cè)， HRTV、HIGV、MalsoorV、GuertuV 4 種病毒的檢測(cè)結(jié)果，除了陽(yáng)性對(duì)照(質(zhì)粒)獲得陽(yáng)性結(jié)果外，180 份血清樣本與陰性對(duì)照均為陰性。SFTSV 的檢測(cè)結(jié)果：陽(yáng)性 92 份、陰性 88 份，SFTSV 的檢出陽(yáng)性率為 51.11%(92/180)。 92 例 SFTS 確診病人分布在岱山本島有 69 例、長(zhǎng)涂島有 12 例、衢山島 2 例、大貓摘箬山島 5 例、金塘島 2 例、枸杞島 2 例，見圖 2。
2.3 傳播媒介中 5 種病毒監(jiān)測(cè)結(jié)果
疫區(qū)鼠肺 283 份， 每個(gè)鼠肺為一組。 疫區(qū)恙螨 605 只，每 100 只為一組共分 6 組。疫區(qū)蜱 200 只，每 10 只為一組共分 20 組。實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 檢測(cè)上 述 樣 本 中 的 SFTSV、HRTV、HIGV、MalsoorV、 GuertuV 5 種病毒核酸 RNA，檢測(cè)結(jié)果均為陰性。
2.4 陽(yáng)性樣本特異性基因鑒定結(jié)果
SFTSV 具有 L、M、S 3 個(gè)特異性基因節(jié)段，用巢式 PCR 對(duì) 92 份陽(yáng)性血清進(jìn)行 L、M、S 3 個(gè)特異性基因節(jié)段檢測(cè)確認(rèn)，檢測(cè)結(jié)果顯示 92 份均能檢測(cè)到 SFTSV 3 個(gè)特異性基因，因此可以確認(rèn)上述 92 例臨床疑似病人均為 SFTSV 病毒感染所致。 SFTSV 的 3 個(gè)特異性基因(M、S、L)的巢式 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別是：420 bp、601 bp、1 020 bp，見圖 3。
2.5 陽(yáng)性樣本病毒分離鑒定結(jié)果
在 92 份陽(yáng)性血清中挑選適合病毒分離(距發(fā)病時(shí)間 5 d 以內(nèi)、CT 值<35) 的樣本 65 份進(jìn)行病毒分離，在 65 份血清樣本中分離到 SFTSV 47 株，分離陽(yáng)性率為 72.31%(47/65)。 SFTSV 致 Vero 細(xì)胞病變形態(tài)，見圖 4。
2.6 病毒基因序列測(cè)定分析與聚類進(jìn)化樹構(gòu)建
47 株 SFTSV 可分為 A 與 B 兩個(gè)基因型，A 基因型占 25.53%(12/47)、B 基因型占 74.47%(35/47)， A 與 B 兩基因距離在 0.046～0.054，由于同一基因型內(nèi)的序列聚類差異原因，B 基因型分成 2 個(gè)進(jìn)化分支，A 基因型可分為 3 個(gè)進(jìn)化分支，5 個(gè)進(jìn)化分支之間的基因距離 0.019～0.038。 B 基因型中第一分支占 94.29%(33/35)，主要分布在岱山本島，分支內(nèi) 33 株病毒之間的同源性均≥99.5%， 與基因庫(kù)中同源性最高的是 Zhejiang/01/2011(KJ597832)毒株，序列同源性為 99.99%，是 B 基因型中一支相對(duì)獨(dú)立的進(jìn)化系統(tǒng)被稱為舟山系[11]。B 基因型中第二分支占 5.71% (2/35)，僅分布在嵊泗枸杞島，分支內(nèi) 2 株病毒的同源性 99.99%，與基因庫(kù)中同源性最高的是日本毒株 SPL053A(AB985523)序列同源性是99.71%。 A 基因型中第一分支占 41.67%(5/12)，主要分布在岱山長(zhǎng)涂島，分支內(nèi) 5 株病毒株間的序列同源性均≥99.6%，與基因庫(kù)中同源性最高的是韓國(guó)毒株 CB3(KY789440)，序 列 同 源 性 是 99.08%。 A 基因型中第二分支占 41.67%(5/12)，主要分布在定海的大貓摘箬山島，分支內(nèi)毒株間的序列同源性均≥99.50%，與基因庫(kù)中同源性最高的是寧波毒株NB34(KR698327)，序列同源性是 99.54%。 A 基因型中第三分支占16.66%(2/12)，僅分布在岱山大衢島， 分支內(nèi)的 2 株病毒同源性 99.99% ， 與基因庫(kù)中同源性最高的是 江蘇毒株 JS2011-109(KC505140)，序列同源性是 99.71%。 寧波舟山港域內(nèi)的 SFTSV 聚類進(jìn)化樹見圖 5。
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3 討論
本次監(jiān)測(cè)用于 SFTSV、HRTV、HIGV、MalsoorV、 GuertuV 5 種病毒檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 方法經(jīng)過(guò)靈敏度、重復(fù)性、特異性及擴(kuò)增曲線等重要指標(biāo)驗(yàn)證均取得比較滿意的結(jié)果， 唯一欠缺的是未能獲 得 HRTV、HIGV、MalsoorV、GuertuV 4 種 病 毒 的陽(yáng)性參照樣本， 因此只能選用特異性的陽(yáng)性質(zhì)粒取代， 根據(jù)既往的工作經(jīng)驗(yàn)應(yīng)用陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)檢測(cè)結(jié)果的可靠性不會(huì)造成較大的影響。 通過(guò)對(duì) 2014—2017 年舟山各醫(yī)院上送的 180 份臨床 SFTS 疑似病例監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示： 除 SFTSV 外其余 4 種病毒均為陰性， SFTSV 核酸的檢出率為 51.11%(92/180) 稍為偏低的原因是與送檢樣本關(guān)系密切， 本次監(jiān)測(cè)因考慮到其他 4 種病毒的存在可能，只要有發(fā)熱、血小板白細(xì)胞降低、轉(zhuǎn)氨酶升高、不分發(fā)病季節(jié)與病人年齡均作為 SFTS 疑似病例樣本收集， 若是典型樣本的檢出率則可明顯提高。 用上述實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 對(duì)1 088 份傳播媒介的檢測(cè)結(jié)果全部陰性與浙江省疾控中心和山東大學(xué)結(jié)果一致[16]。 本地沒(méi)有 Guertu 病毒宿主-長(zhǎng)尾黃鼠與草原革蜱[17]，HRTV、HIGV 與MalsoorV 病毒分布于美國(guó)、澳大利亞與印度，上述情況可能是檢測(cè)陰性的主要原因。 從上述監(jiān)測(cè)結(jié)果來(lái)分析，當(dāng)前寧波舟山港域區(qū)內(nèi)發(fā)熱伴血小板綜合征病原體為單一的 SFTSV，未見有其他類 SFTSV 傳入。
復(fù)旦大學(xué)的付永鋒博士根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析表明當(dāng)前的 SFTSV 可以分為 6 種基因型，不同基因型之間的基因距離為 0.035～0.062。F、A、D 基因型在中國(guó)大陸地區(qū)占主導(dǎo)地位，E 基因型僅在江蘇和山東被發(fā)現(xiàn)，B 基因型在日本和韓國(guó)占主導(dǎo)地位，但是沒(méi)有在中國(guó)大陸被發(fā)現(xiàn)[11]。 當(dāng)前流行于寧波舟山港域內(nèi)的 B 基因型病毒是本地的主要流行病毒株，具有相對(duì)獨(dú)立的遺傳特征與流行于日韓的 B 基因型病毒基因序列有較大的差異，基因距離為 0.038。 因此寧波舟山港域內(nèi)臨床病例在發(fā)病率與病死率、 感染發(fā)生時(shí)間與感染年齡、 虛弱與腹脹等臨床癥狀也與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)有一定差異。 另一個(gè)遺傳進(jìn)化特征是每個(gè)進(jìn)化分支在各島內(nèi)聚集比較明顯，如 B 基因中第一分支的 33 株病毒聚集于岱山本島;B 基因中第二分支的 2 株病毒聚集于靠近公海的枸杞島;A 基因第一分支的 5 株病毒聚集于岱山島、長(zhǎng)涂島;A 基因中第二分支 5 株病毒聚集于緊靠寧波的大毛摘箬山島;A 基因中第三分支 2 株病毒聚集于大衢島;可能是通過(guò)海鳥傳播，也可能是通過(guò)外輪修理(長(zhǎng)涂島上有大型船廠與韓國(guó)外輪關(guān)系密切) 或通過(guò)大宗農(nóng)產(chǎn)品轉(zhuǎn)運(yùn)中的傳播媒介傳播。 總之 SFTSV 的傳播途徑還不十分明確， 因此今后需嚴(yán)密關(guān)注重視國(guó)際上新發(fā)傳染病病原體的檢驗(yàn)被檢疫工作。
