發(fā)布時(shí)間：2015-10-10所屬分類：醫(yī)學(xué)職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 相信大家對(duì)深市體外細(xì)胞毒性以及顏面贗復(fù)體粘接劑等這些信息不是很了解，怎樣來充分的認(rèn)識(shí)呢?又該怎樣來加強(qiáng)這方面的管理治療措施呢?本文在此做了相應(yīng)的介紹。文章選自：《中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志》,《中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志》為中國科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)主管、
相信大家對(duì)深市體外細(xì)胞毒性以及顏面贗復(fù)體粘接劑等這些信息不是很了解，怎樣來充分的認(rèn)識(shí)呢?又該怎樣來加強(qiáng)這方面的管理治療措施呢?本文在此做了相應(yīng)的介紹。文章選自：《中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志》,《中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志》為中國科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)主管、中華醫(yī)學(xué)會(huì)主辦的醫(yī)學(xué)病毒學(xué)專業(yè)學(xué)術(shù)期刊，國內(nèi)外公開發(fā)行。該刊為雙月刊，主要報(bào)道我國醫(yī)學(xué)病毒學(xué)的應(yīng)用及基礎(chǔ)理論研究，人類病毒性疾病預(yù)防、診斷、流行病及臨床治療等方面的新技術(shù)、新方法、新進(jìn)展、新成果，以及國外在該領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展。
摘要：由于生物材料容易浸出能引起組織反應(yīng)或炎癥反應(yīng)的物質(zhì),這些物質(zhì)大多是原料單體、小分子聚合物、溶劑等,所以生物材料在應(yīng)用于人體之前,都必須經(jīng)過嚴(yán)格的檢驗(yàn),除臨床應(yīng)用所要求的機(jī)械及理化性能外,還應(yīng)具備良好的生物相容性[7]. 國際標(biāo)準(zhǔn)化組織發(fā)布了ISO 10993醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)系列標(biāo)準(zhǔn)中,細(xì)胞毒性試驗(yàn)以其簡便、快捷、靈敏性高、節(jié)省動(dòng)物等優(yōu)點(diǎn)被列為首選試驗(yàn)項(xiàng)目.
關(guān)鍵詞：體外細(xì)胞毒性,醫(yī)學(xué)論文,論文發(fā)表
顏面贗復(fù)體的固位中組織倒凹和機(jī)械固位多用作輔助方式,種植體固位雖然是顏面贗復(fù)體首選的固位方式[1],但由于多種原因使患者不能接受種植手術(shù)時(shí), 就需依賴粘接固位. 傳統(tǒng)的贗復(fù)體粘接劑中,聚丙烯酸酯類粘接劑價(jià)廉,粘接強(qiáng)度尚可,但皮膚上的粘接劑殘留較難去除[2];有機(jī)硅類粘接劑粘接強(qiáng)度高,皮膚殘留少,但含有機(jī)溶劑具有潛在刺激性[3]. 我們通過乳液聚合的方法合成有機(jī)硅改性聚丙烯酸酯類的顏面贗復(fù)體粘接劑1(facial prosthesisskin adhesive1,FPSA1),并參照國際標(biāo)準(zhǔn)化組織發(fā)布的醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)行體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)[4],將小鼠肺成纖維細(xì)胞(L929)在離體狀態(tài)下進(jìn)行培養(yǎng),以探討FPSA1浸提液對(duì)L929細(xì)胞生物學(xué)活性的影響,評(píng)價(jià)其生物的相容性.
1材料和方法
1.1材料FPSA1 (第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院與西北工業(yè)大學(xué)聯(lián)合研制);無菌濾紙, 高壓蒸汽滅菌后備用. L929細(xì)胞株(第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部免疫學(xué)教研室);DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco公司);含100 mL/L的標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(FBS,杭州四季青公司);100 kU/L氨芐青霉素、100 kU/L硫酸鏈霉素, pH=7.2~7.4;胰蛋白酶,四甲基偶氮唑鹽(MTT) (美國Sigma公司);四甲基偶氮唑鹽溶液,實(shí)驗(yàn)前用磷酸鹽緩沖液(PBS)新鮮配制, 濃度為5 g/L,過濾除菌后4℃避光保存,1 wk內(nèi)使用. 二甲基亞砜(DMSO, 北京索萊寶公司); 倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS TH4200);超凈工作臺(tái)(AIR TECH,蘇凈集團(tuán)安泰公司);CO2培養(yǎng)箱(HERA cell 150, Germany);25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶,96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(NUNC,丹麥).
1.2方法
1.2.1浸提液制備將無菌濾紙裁成1 cm×1 cm試樣備用, 按每面涂50 μL的粘接劑使濾紙浸漬均勻,清潔空氣輕吹2~3 min,待粘接劑由白色乳液變至無色透明膠膜,依照ISO 1099312樣品制備要求[5],試樣按表面積與浸提介質(zhì)比6 cm2/mL加入含100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)液中,另將未涂粘接劑的無菌濾紙作為陰性對(duì)照按同樣比例浸于相同培養(yǎng)液,放置在37℃,50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)浸提72 h,分別得到1000 mL/L FPSA1浸提液和陰性對(duì)照組浸提液,過濾除菌. 再將1000 mL/L浸提液經(jīng)DMEM培養(yǎng)液稀釋成500,750 mL/L濃度浸提液備用.
1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)將對(duì)數(shù)生長期的L929細(xì)胞經(jīng)2.5 mL/L胰酶消化、吹打分散后計(jì)數(shù),用含100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)液配成濃度為1×107/L的細(xì)胞懸液,按每孔100 μL的細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板上,放入37℃,50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中. 四周邊緣孔不接種細(xì)胞,每孔加入100 μL的DMEM培養(yǎng)液,起邊緣封閉作用.
1.2.3MTT測試細(xì)胞培養(yǎng)24 h后棄去原培養(yǎng)液,用PBS洗滌2次,進(jìn)行培養(yǎng)液交換,按每孔200 μL分別加入500,750 mL/L的FPSA1浸提液,另設(shè)陰性和陽性對(duì)照組,分別加入等量無菌濾紙浸提液和含6.4 mL/L苯酚的培養(yǎng)液,每組重復(fù)6孔,常規(guī)培養(yǎng),每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及增殖情況. 分別于加樣后2,4,7 d取出96孔板,在受試孔中每孔加入20 μL的MTT溶液,37℃,50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中保溫4 h后棄去舊液,每孔加入150 μL的DMSO,振蕩10 min,在多道掃描酶標(biāo)儀上測A490 nm值,計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)增殖率(RGR). RGR(%)=(實(shí)驗(yàn)組A490 nm/陰性對(duì)照組A490 nm)×100%,細(xì)胞毒性分級(jí)按如下標(biāo)準(zhǔn)[6]評(píng)價(jià): RGR≥100為0級(jí);80~99為1級(jí);50~79為2級(jí);30~49為3級(jí);0~29為4級(jí).
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,對(duì)數(shù)據(jù)采用方差分析和Tukey多重比較檢驗(yàn) (α=0.05).
2結(jié)果
2.1MTT測定加樣后2,4,7 d,陽性對(duì)照組與其余各組的A值之間均有顯著性差異(P<0.01), 500 mL/L和750 mL/L FPSA1浸提液組之間A490 nm差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表1);在各時(shí)相500 mL/L和750 mL/L FPSA1浸提液組的RGR均大于80%,參照標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分FPSA1的細(xì)胞毒性為1級(jí),各組細(xì)胞RGR及毒性評(píng)級(jí)結(jié)果見表2.
表1FPSA1與對(duì)照組的A490 nm值(略)
bP<0.01 vs 陰性對(duì)照, 500 mL/L FPSA1,750 mL/L FPSA1. FPSA1: 顏面贗復(fù)體粘接劑1.
表2FPSA1與對(duì)照組的RGR及細(xì)胞毒性等級(jí)(略)
bP<0.01 vs 陰性對(duì)照,500 mL/L FPSA1,750 mL/L FPSA1. FPSA1: 顏面贗復(fù)體粘接劑1.
2.2倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況加樣后2,4,7 d,在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況,陰性對(duì)照組L929細(xì)胞形態(tài)正常,呈梭形,細(xì)胞突充分伸展,隨著時(shí)間延長,細(xì)胞數(shù)量增加(圖1A);500 mL/L FPSA1浸提液組細(xì)胞形態(tài)正常,生長良好,750 mL/L FPSA1浸提液組局部可見少量細(xì)胞出現(xiàn)溶解或壞死(圖1B,C);陽性對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量明顯減少,大量細(xì)胞出現(xiàn)固縮、壞死、崩解(圖1D).
3討論
MTT法應(yīng)用材料浸提液檢測其細(xì)胞毒性,對(duì)受試材料溶出物的毒性檢測敏感性較高,也比較符合動(dòng)物體內(nèi)的毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果,是一種較好的體外評(píng)價(jià)生物材料細(xì)胞毒性的研究方法[8]. L929細(xì)胞具有傳代穩(wěn)定、繁殖迅速、體外培養(yǎng)條件低、能為許多材料細(xì)胞毒性所共用等優(yōu)點(diǎn),成為細(xì)胞毒性試驗(yàn)中應(yīng)用最早且使用最廣泛的細(xì)胞.
A: 陰性對(duì)照組; B: 50 mL/L FPSA1浸提液組; C: 750 mL/L FPSA1浸提液組; D: 陽性對(duì)照組.
圖1倒置顯微鏡觀察加樣后7 d各組L929細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化×100(略)
我們采用500 mL/L和750 mL/L FPSA1浸提液進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn),以檢測細(xì)胞毒性是否與材料溶出物有關(guān),以及溶出物濃度與細(xì)胞毒性的劑量依賴關(guān)系,可以比較全面地評(píng)價(jià)FPSA1的細(xì)胞毒性. 經(jīng)500 mL/L和750 mL/L FPSA1浸提液培養(yǎng)的L929細(xì)胞,在加樣2,4和7 d后,細(xì)胞RGR均在80%以上,細(xì)胞毒性為1級(jí),各濃度浸提液組之間RGR無顯著差異,提示L929細(xì)胞增殖與FPSA1浸提液的濃度無明顯相關(guān),符合生物材料的醫(yī)用標(biāo)準(zhǔn). 與陰性對(duì)照組相比,750 mL/L FPSA1浸提液組局部出現(xiàn)少量細(xì)胞溶解或壞死,這可能是由于在細(xì)胞毒性試驗(yàn)中,通常隨著浸提液濃度的增加,細(xì)胞毒性也會(huì)相應(yīng)增加的緣故[9].
FPSA1為有機(jī)硅改性的聚丙烯酸酯類粘接劑,是用含雙鍵的有機(jī)硅單體與丙烯酸酯單體,通過自由基引發(fā)的乳液聚合反應(yīng)合成的. 在聚合反應(yīng)過程中加入了離子型和非離子型的乳化劑,其中離子型乳化劑在制備粘接劑浸提液時(shí)可促進(jìn)膠膜吸水溶解,使得粘接劑膠膜中殘留的丙烯酸酯單體或其它助劑析出,從而表現(xiàn)出輕微的細(xì)胞毒性. 我們的結(jié)果提示在粘接劑合成過程中應(yīng)盡量提高共聚單體功能團(tuán)的交聯(lián)程度即提高單體轉(zhuǎn)化率,或采取相應(yīng)措施以減少粘接劑中的單體殘留,同時(shí)還應(yīng)提高顏面贗復(fù)體粘接劑的耐水性能. 這一方面可通過提高聚合物中有機(jī)硅的含量來實(shí)現(xiàn),另一方面可以在乳液聚合反應(yīng)中使用反應(yīng)型乳化劑以減少離子型乳化劑的使用量. 反應(yīng)型乳化劑在乳化劑分子中含有能發(fā)生自由基聚合反應(yīng)的雙鍵,在反應(yīng)時(shí)參與單體共聚,不以游離聚合物粒子形式存在,從而改善粘接劑的性能[5,8].
綜上所述,本研究采用MTT法評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性,其結(jié)果顯示FPSA1無明顯的細(xì)胞毒性,具有良好的細(xì)胞相容性,是一種具有發(fā)展前景的顏面贗復(fù)體粘接材料.
