發布時間：2022-03-22所屬分類：工程師職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要背景：許多研究證實了生物材料的物理性質尤其是其硬度能夠調控干細胞向目的細胞定向分化。目的：綜述細胞外基質對干細胞行為的影響及生物材料物理性質調控干細胞分化的最新研究進展。方法：由第一作者檢索中國期刊全文數據庫和 Web of Science 數據庫，檢索詞分別
摘要背景：許多研究證實了生物材料的物理性質尤其是其硬度能夠調控干細胞向目的細胞定向分化。目的：綜述細胞外基質對干細胞行為的影響及生物材料物理性質調控干細胞分化的最新研究進展。方法：由第一作者檢索中國期刊全文數據庫和 Web of Science 數據庫，檢索詞分別為 “細胞外基質、生物支架材料、化學性質、物理性質、基質硬度、干細胞分化”和“extracellular matrix, biomaterials scaffolds, chemical properties, physical properties, substrate rigidity, stem cell differentiation”。語言分別設定為中文和英文，最終選擇 31 篇文獻進行綜述。結果與結論：生物材料支架的物理性質能夠影響細胞的增殖、遷移和分化等行為，尤其是硬度調控干細胞分化對組織工程及再生醫學都具有極大的啟示。尋找更多與細胞外基質硬度共同作用的生物化學因素和物理因素，精確控制細胞行為，制備出與體內生理環境更加相似的支架材料值得深入研究和探討。
關鍵詞：干細胞;材料相容性;細胞外基質;組織工程;生物材料;復合材料;物理性質;基底硬度;定向分化
0 引言 Introduction
干細胞對細胞外基質的固有性質非常敏感，基質彈性誘導干細胞分化的重要性已經成為一種新型的敏感性非常高的細胞調節因素。模擬天然細胞外基質設計的生物材料，不僅為細胞和再生組織提供一個暫時的結構支持，同時也能通過傳導必要的生物物理、生物力學和生物化學信號來調節細胞的黏附、增殖、分化以及組織結構的形成。細胞外基質的物理性質，特別是硬度或彈性，能對細胞的黏附、鋪展、增殖、遷移和分化等多種功能和行為產生重要影響。研究基質表面彈性對蛋白吸附及干細胞分化和分泌功能的作用，是組織工程用生物材料設計的一個新思路。文章論述了生物材料物理性質對干細胞分化的影響以及模擬細胞外基質物理性質調控干細胞分化行為的最新研究進展，對未來需要重點研究的問題進行了展望。
1 資料和方法 Data and methods
1.1 文獻檢索和篩選要求
1.1.1 檢索數據庫 中國期刊全文數據庫(CNKI);Web of Science數據庫。
1.1.2 檢索數據庫的選擇理由 Web of Science數據庫和中國期刊全文數據庫分別是國外和國內最權威的生物醫學文獻數據庫，文獻數據多且全面。
1.1.3 檢索途徑、檢索詞及各檢索詞的邏輯關系 為全面、準確地檢索出撰寫該綜述的相關文獻，文章寫作過程中綜合考慮了檢索途徑的選擇、檢索詞的選擇和各檢索詞間邏輯關系的配置，制定了科學的檢索策略。
檢索途徑：關鍵詞檢索、摘要檢索、全文檢索。
檢索詞：中文檢索詞為“細胞外基質、生物支架材料、化學性質、物理性質、基質硬度、干細胞分化”。英文檢索詞為“ extracellular matrix, biomaterials scaffolds, chemical properties, physical properties, substrate rigidity, stem cell differentiation”。
檢索詞的邏輯組配：先以“細胞外基質”AND“支架材料”進行檢索，然后分別將物理性質，化學性質，基質硬度與干細胞分化匹配進行檢索。
1.2 文獻篩選流程和篩選標準
1.2.1 文獻篩選流程 按照圖1的步驟進行。
1.2.2 文獻的篩選標準 ①仿生材料的設計研究;②生物材料的物理化學性質對干細胞行為影響的相關研究。
1.2.3 文獻的排除標準 ①相似的陳舊的文獻;②與此文研究目的不相關文章。
1.2.4 篩選偏離的描述、原因及對結果的影響 該綜述所有納入文章均經組內討論，以避免存在篩選偏離。
1.2.5 文獻篩選結果的輸出形式 文獻檢索和篩選結果的輸出采用文獻的引用形式，且保持了格式的一致性，文獻的引用形式包括作者、題名、期刊名稱、發表年代、卷數(期數)、頁碼等。經篩選納入評價的文獻提供了全文。
2 結果 Results
2.1 細胞外基質對細胞行為的影響 細胞外基質是由動物細胞合成并分泌到胞外、分布在細胞表面或細胞之間 的大分子，主要是一些多糖和蛋白或蛋白聚糖。細胞外基質不僅具有連接、支持、保水、抗壓及保護等物理學作用，而且對細胞的基本生命活動發揮著全方位的生物學作用，如支持并連接組織結構、調節組織的發生和細胞的生理活動等。細胞和細胞之間，細胞和細胞外基質之間的相互作用以及溫度、營養、細胞因子等共同構成的組織環境稱為微環境。干細胞的微環境又稱為干細胞 Niche(干細胞壁龕) [1]，其在干細胞生長和功能的維持和調節中起到重要的作用。微環境對細胞增殖分化的影響主要有3個方面：①細胞與細胞的相互影響;②細胞與細胞外基質的互相影響;③可溶性信號分子的影響[2]。
干細胞的命運受控于細胞微環境中的信號分子，而細胞外基質是構成細胞微環境的重要因素之一，為細胞提供空間和機械刺激從而引導細胞的行為，細胞與細胞外基質之間的物理作用調節原始細胞程序，包括分化、遷移和增殖[3]。
活細胞對環境的感應有著許多智能系統的特點，一個細胞可以感覺和回應很多化學和物理的外界信號，它可以整合和分析這些信息，從而改變自身的形態、動態行為甚至能改變最后的命運。細胞利用細胞外基質和臨近細胞之間構成的信號去建立和維持它們的形狀和生理特性，這種多樣性在生物系統中常常與細胞的功能緊密聯系。細胞必須感應微環境的物理性質，并隨著時間推移適當地做出回應，從而來取得細胞功能。當干細胞受到細胞外基質固有性質(如基質結構、表面彈性及組成成分)的影響時，干細胞開始向成熟的組織細胞分化，這些性質可以調節細胞作用于基質的應力。機械敏感通道隨后把這些生物物理信息轉化成生物信號，這些生物化學信號能促進干細胞的特異性分化。就像加入了生長因子一樣，細胞外基質固有性質的作用非常強大，它們可以在時空上控制干細胞的發育，即它們在誘導干細胞分化及組裝時起到形態控制的作用。尤其是干細胞的命運和種系分化緊密地依賴于細胞外基質的彈性和表面微觀結構。
2.2 仿生材料設計研究 組織工程研究的熱點主要集中在3個方面，即種子細胞、支架材料和生物因子。支架材料是組織工程的基礎，是組織工程成敗的關鍵因素，它是模擬天然細胞外基質的支架材料，有利于細胞黏附、增殖乃至分化，為細胞生長提供合適的外環境。
2.2.1 對仿生材料的要求 仿生材料是為細胞組織的生長提供營養和代謝產物的三維多孔結構的載體，是一種仿生的細胞外基質，不僅要有良好的細胞相容性，提供合適的力學強度，而且在結構(二維結構和三維結構)、生化組成和功能上都仿生。因此，選擇支架材料時除了符合一般生物醫學材料的要求外，組織工程學所需的理想支架材料應盡可能滿足以下要求：①生物相容性和表面活性：有利于細胞的黏附，并且具有無毒，不致畸，不引起炎癥反應等特點，為細胞的生長提供良好的微環境，能安全用于人體;②生物可降解性：在組織形成過程中逐漸降解，并且具有合適的降解速率，與組織細胞的生長速度相一致，降解時間應能調控;③合適的表面理化性質和較高的比表面積：有利于細胞的黏附、鋪展、遷移、增殖、分化等行為產生;④合適的孔徑和孔隙率[4]：這樣有利于細胞的黏附和組織的生長，促進新生組織向材料內部的長入，利于營養成分的運輸和代謝產物的排出;⑤合適的機械強度和可塑性：為新生組織提供支撐的作用，生物材料的機械強度要保持一定時間直至重生組織具有自身生物力學特性。材料被加工成所需的形狀，并且在植入體內后的一定時間內仍可保持其形狀。
2.2.2 仿生材料的分類 仿生材料的種類有很多，根據材料的來源可以分為天然生物材料、合成生物材料和復合生物材料。
天然生物材料：天然生物材料直接來源于動植物或人體。由于來自于生物體，所以天然材料具有良好的組織相容性，無明顯的毒性，能最終降解為多糖或氨基酸而被機體吸收，并且不易引起炎癥反應和免疫反應。按照結構分類主要可以分為：天然蛋白質，如明膠、膠原、彈性蛋白、纖維蛋白;蔡國徽等[5]以膠原Ⅰ為支架材料，建立卵巢癌細胞體外三維培養模型，膠原Ⅰ具有良好的結構與性能，適宜于卵巢癌細胞體外三維培養，并能較好地維持卵巢癌細胞的形態和功能。多糖類物質，如殼聚糖[6]、葡聚糖、糖胺聚糖、細菌纖維素、透明質酸以及其他海藻酸鹽等。天然材料的優點在于無抗原性，能夠介導細胞間信號傳導，也可通過釋放活性因子來促進細胞黏附、增殖及分化，具有良好的生物相容性。但是其缺點也很明顯，例如難以控制降解速率、物化性質的單一性、較差的重現性和力學性能，使其難以大批量生產，同時異種移植的問題以及異種蛋白成分的存在可能會導致免疫反應等。
合成生物材料：合成材料種類很多，與天然材料相比，除了能克服天然材料的力學性能和重復性差、降解速度和強度不可調節等缺點之外，還具有原始材料來源充足，可以被制成各種所需的形狀，構建高孔隙率三維支架，可人為修飾和調控其結構和性能等優點。
根據原始材料的種類可分為：人工合成高分子材料如聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚乙內酯 (PCL)、聚丙交酯與聚乙交酯共聚物(PLGA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等;無機非金屬合成材料如鈣磷陶瓷、羥基磷灰石、生物玻璃、磷酸鈣骨水泥、碳材料以及生物惰性的氧化鋁和氧化鋯等;某些金屬材料如鎂合金、鈦及其合金、鎳鈦合金等。小鼠誘導多功能干細胞在聚乙內酯靜電紡絲納米纖維支架上具有良好黏附性并呈集落樣生長，其增殖能力及干性標記物的表達均不亞于標準對照組;掃描電鏡顯示，小鼠誘導多功能干細胞在聚乙內酯靜電紡絲納米纖維支架材料上呈現出絨毛狀突起的表面結構。結果表明，聚乙內酯靜電紡絲納米纖維支架可促進小鼠誘導多功能干細胞的黏附、自我增殖以及干性維持，兩者具有良好的生物相容性，為聯合生物支架材料與干細胞構建功能性組織奠定了基礎[7]。相較于天然材料，人工合成材料可塑性更佳，不僅具有良好的力學性能，而且具有豐富的加工手段，并可通過相對分子質量調節降解速率。缺點是生物相容性較差、生物活性較低，對細胞親和力弱，細胞黏附性較差，降解副產物多種多樣，降解速率快，產生的大量副產物會改變機體的微環境導致細胞和組織的壞死等[8]。
復合生物材料：單純應用天然材料或者合成材料制造的組織工程支架，或多或少都存在某些無法避免的缺陷，因此，目前廣大學者已將研究重點轉移到使用2種或2種以上不同材料相混合的方法來構建復合材料，以克服單一使用某種材料的不足。復合材料是集中多種材料的優點，彌補各自的不足之處。
常見的復合材料主要有：同一類生物材料的復合、不同類別生物材料之間的交叉復合。天然高分子材料之間構建的復合材料，主要是為了使獲得的組織工程支架從組分上盡可能與天然細胞外基質相類似。采用膠原-殼聚糖、膠原-透明質酸、殼聚糖-明膠等天然材料構建組織工程支架的研究已有報道。以生物相容性好的殼聚糖作為基質材料，與力學強度較高的聚乳酸復合制備了網絡互穿殼聚糖/聚乳酸復合支架。結果證明干態復合材料的壓縮強度和模量分別比純殼聚糖支架提高了6倍和15倍，能夠促進骨缺損的愈合[9]。馮超等[10]研究者利用人發角蛋白、絲素蛋白以及明膠在合適比例下制備的改良發角蛋白/絲素蛋白復合材料力學特性最佳，具有更為理想的生物相容性及降解速率，無明顯細胞毒性。還有將羥基磷灰石、膠原、聚丙交酯與聚乙交酯共聚物混和制成的所需形狀的支架，可為細胞間相互作用及骨連接提供更好的生物條件[11]。 Kikuchi[12]利用滴定法，在合適的溫度和pH值條件下，已經成功合成了羥基磷灰石/膠原復合材料，并且該復合材料已經通過日本政府的審批，將會用于需要骨填充的患者身上。王嬌娜等[13]利用激光熔融靜電紡絲技術制備了聚乳酸/聚乙內酯及聚乳酸/聚乙內酯/納米羥基磷灰石復合纖維，研究結果表明，復合纖維支架的直徑和孔結構具有多樣性，納米羥基磷灰石能夠提高聚乳酸/聚乙內酯層壓纖維支架的親水性，改善支架的細胞相容性，增加細胞的附著能力，提高細胞的存活率。
2.3 生物材料的理化性質對細胞行為的影響 在組織工程中，細胞一般都是在模擬細胞外基質的生物支架材料上人工培養擴增誘導植入到體內。細胞在生物支架材料上的生物學行為，如變形、遷移、增殖、分化等都與細胞支架材料間相互作用密切相關。由于細胞與材料間生物理化因素的存在，細胞與支架間的相互作用也就受到多種因素影響。支架的力學性能、化學及生物物理因素能夠影響細胞的鋪展形態和面積以及細胞間的接觸，進一步對細胞的生長、遷移和分化等行為起到重要的調節作用。
2.3.1 生物材料的化學性質對細胞行為的影響 生物材料表面的化學官能團、親疏水性及帶電性影響著黏附在材料表面的細胞。許多研究通過改變材料表面的化學性質，可以改變干細胞在生物材料上黏附、增殖分化及吸附蛋白質構象的能力[14-15]。
生物材料表面的電荷影響著干細胞的分化，Guo 等[16]將帶正電的聚烯丙基胺(PAAm)、帶負電的聚丙烯酸(PAA)、不帶電的聚乙二醇(PEG)用光接枝的方法固定到細胞培養板的表面，然后將骨髓間充質干細胞分別接種到這3種材料表面，在軟骨細胞誘導液的培養條件下，帶正電的聚烯丙基胺和不帶電的聚乙二醇表面支持骨髓間充質干細胞向軟骨分化，而帶負電的聚丙烯酸表面不能支持骨髓間充質干細胞向軟骨分化。材料的化學性質除對蛋白質的吸附和細胞的分化有影響外，同時也是影響細胞黏附生長行為的重要因素。在材料表面加上生物特異性基團如羧基、氨基等，有利于細胞在材料表面的吸附和分化。
Yan等[17]將NH2、COOH、CH3基團接枝到材料表面，由于tallin蛋白是細胞伸展和黏附的加速器，所以他們通過檢測tallin蛋白在細胞中的分布來判斷官能基團對細胞在材料表面吸附的影響，實驗結果顯示接枝NH2、 COOH的基片表面的tallin蛋白量多于接枝CH3的基片表面。同時NH2基團有誘導脂肪干細胞向成骨分化的趨勢，而苯基和巰基表面可促進脂肪干細胞向軟骨細胞方向分化[18]。
本文來源于：《中國組織工程研究》雜于1997年創辦，發表組織工程研究中關于干細胞培養與移植、組織構建、材料生物相容性評價(天然或合成材料與納米粒子、人工材料植入體、植入器官及外源性細胞)、計算機輔助骨外科技術的應用基礎及臨床研究，轉化醫學和循證醫學研究的文章，發表中國組織工程研究領域一流水平的學術、技術創新成果。
2.3.2 生物材料的物理性質對細胞行為的影響 由于細胞與材料間生物物理因素的存在，細胞與支架間的相互作用也就受到多種因素影響，包括基質的硬度、表面形貌以及細胞所受的外力等力學因素[19]。有研究表明不同硬度的基質材料可以誘導間充質干細胞向不同譜系細胞分化。基質硬度不僅影響細胞形態，也影響了細胞基因的表達[20-21]。模擬不同組織硬度的細胞外基質均能誘導干細胞分化成不同類型的細胞。
Engler等[20]在表面修飾Ⅰ型膠原蛋白且硬度不同的聚丙烯酰胺水凝膠上分別培養人骨髓間充質干細胞，實驗結果顯示，在沒有誘導因子的條件下，將人骨髓間充質干細胞培養在模擬腦組織硬度的軟凝膠(0.1- 1.0 kPa)上，骨髓間充質干細胞向神經細胞方向分化;將骨髓間充質干細胞培養于模擬肌肉組織硬度的較硬凝膠(8-17 kPa)上，骨髓間充質干細胞向肌細胞方向分化;當硬度進一步增加，將骨髓間充質干細胞培養于模擬類骨質硬度的水凝膠(25-40 kPa)上時，骨髓間充質干細胞呈現與成骨細胞相似的多角形，并且成骨細胞標志分子RUNX2表達水平上調，表明骨髓間充質干細胞向成骨細胞方向分化。
Xue等[22]通過調整丙烯酰胺(Acrylamide)、交聯劑 (Cross-linker)、雙丙烯酰胺(Bis-acrylamide)的相對濃度來調節基底硬度，將骨髓間充質干細胞分別接種到不同硬度的聚丙烯酰胺水凝膠基底上，結果顯示成骨分化標記基因ALP，Col1α1，Runx2 mRNA水平在硬基底(40.0±3.6) kPa上明顯升高，表明基底硬度就能促進骨髓間充質干細胞的成骨分化;另外軟骨分化標記基因SOX-9，Aggrecan，Collagen Ⅱ和Collagen Ⅹ 的mRNA水平在軟基底(1.6±0.3) kPa上顯著升高， SOX9蛋白表達在軟基底上明顯升高，Alcian blue染色和Collagen Ⅱ免疫熒光染色結果均顯示軟基底更有利于軟骨分化。此外，不僅單一的細胞外基質硬度影響著間充質干細胞的分化，硬度梯度也能在間充質干細胞分化中發揮作用。
Navaro等[23]將髓核間充質干細胞分別接種到2種不同彈性模量 TF 水凝膠 (tetronic 1307- fibrinoge hydrogel)上，彈性模量G0=1 kPa的基底促進軟骨的形成，而彈性模量G0=2 kPa的基底有利于向成骨細胞分化。無論在生理還是在病理上，機體內組織和器官的硬度都存在一定的梯度，因此梯度硬度也能在間充質干細胞分化中發揮作用。
Kim等[24]制備剛度是沿縱向從頂部1 kPa到底部 24 kPa的方向逐漸增加的圓柱形聚乙烯醇水凝膠，將骨髓間充質干細胞接種到水凝膠上，其中軟基底和硬基底分別有效促進了神經分化和成骨分化。Tse等[25] 通過構建細胞外基質硬度梯度的聚烯丙基胺凝膠，發現多數間充質干細胞具有向細胞外基質硬度較大方向遷移的趨勢，并分化為成肌細胞。另外，Sharma等[26] 利用聚烯丙基胺凝膠模擬類骨質的硬度范圍，構建了4 種硬度梯度的基質，其中70-90 kPa梯度的基質能誘導間充質干細胞表達成骨細胞標志分子RUNX2和堿性磷酸酶，在硬度梯度為10-90 kPa纖連蛋白表面修飾的基質中，硬度大于20 kPa的區域有鈣結節形成，說明間充質干細胞向成骨細胞分化。細胞外基質硬度不僅能促進間充質干細胞分化，還可以促進胚胎干細胞向特定細胞分化。
Arshi等[27]將胚胎干細胞培養在含不同比率單分子交聯劑的聚二甲基硅氧烷(PDMS)基質上，實驗結果顯示，硬性的細胞外基質促進胚胎干細胞向心肌細胞分化。此外，基質硬度可以維持胚胎干細胞的干性。 Park等[28]研究發現，間充質干細胞在硬基質上的伸展性和增殖能力都明顯比軟基質上減弱，在硬基質上生長的間充質干細胞更趨向于向成骨細胞分化，而軟基質上生長的間充質干細胞向成軟骨方向和成脂方向的分化比例明顯高于硬基質上的間充質干細胞。軟基質對于Rho誘導的應力纖維的形成和α-actin的裝配沒有明顯的影響。進一步的分析表明間充質干細胞在軟基質上的黏附力比硬基質明顯減弱，這可能是基質軟硬度對于干細胞分化影響的主要機制。
3 小結 Conclusion
生物材料支架的物理性質能夠影響細胞的增殖、遷移和分化等行為[29-31]，尤其是硬度調控干細胞分化對組織工程及再生醫學都具有極大的啟示。目前，對于細胞外基質硬度調控干細胞分化還有許多方面需要深入的探討，如除了材料硬度這一因素能調控干細胞分化外，還有其他物理因素、化學因素影響著干細胞的分化，材料硬度單獨誘導分化的細胞在形態、結構和功能等方面與正常的成熟細胞相比有較大的差異，因此需要尋找更多與細胞外基質硬度共同作用的生物化學和物理因素，精確控制細胞行為。如何能夠制備出與體內生理環境更加相似的支架材料值得深入研究和探討。
組織工程生物材料支架的最終目的是用于臨床治療，組分上盡可能與細胞外基質相類似，減小與體內環境的差異性。除此之外，還要必須考慮一些在設計和制備中的實際問題，如材料的機械性能是否有利于實際應用的操作，材料是否容易消毒，材料是否可以大規模加工生產，是組織工程材料能夠用于臨床的根本目的。——論文作者：鄭力恒1，2 ，吳 昊2，3 ，尚玉攀4 ，張嘉晴4
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