發(fā)布時(shí)間：2022-01-23所屬分類：農(nóng)業(yè)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘 要 本研究應(yīng)用 DNA 條形碼技術(shù)，以 ITS 序列為目的片段對(duì)口岸截獲的擬石蓮屬多肉植物進(jìn)行快速鑒定。對(duì) 11 種 36 份擬石蓮屬供試樣本 ITS 片段進(jìn)行通用引物擴(kuò)增，并雙向測(cè)序拼接，利用 MEGA7 軟件進(jìn)行序列比對(duì)，分析各種類種內(nèi)和種間 K2P 遺傳距離，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
摘 要 本研究應(yīng)用 DNA 條形碼技術(shù)，以 ITS 序列為目的片段對(duì)口岸截獲的擬石蓮屬多肉植物進(jìn)行快速鑒定。對(duì) 11 種 36 份擬石蓮屬供試樣本 ITS 片段進(jìn)行通用引物擴(kuò)增，并雙向測(cè)序拼接，利用 MEGA7 軟件進(jìn)行序列比對(duì)，分析各種類種內(nèi)和種間 K2P 遺傳距離，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。研究表明，供試材料 ITS 序列的種內(nèi)差異顯著小于種間差異，種內(nèi)種間差異存在明顯的間隔區(qū)，所有樣品按種類在 NJ 樹(shù)上嚴(yán)格聚成單系，種間區(qū)分明顯。經(jīng)初步判定，ITS 具有作為擬石蓮屬多肉植物 DNA 條形碼的潛在可能。
關(guān)鍵詞 擬石蓮屬;DNA 條形碼;ITS
近年來(lái)，多肉植物日益受到園藝愛(ài)好者青睞，景天科擬石蓮屬就是其中之一 [1]。擬石蓮屬也稱石蓮花屬，種類繁多，據(jù)記載有 167 個(gè)原始種，主要分布于美國(guó)南部、墨西哥以及中美洲各國(guó) [2]，因其葉片排列呈蓮座狀而得名。擬石蓮屬多肉植物主莖短粗，部分種類主莖有分支，葉片叢生、肉厚，葉色多變，形狀美觀，同時(shí)兼具耐干旱、易繁殖的特點(diǎn)，因此，擬石蓮屬多肉植物在我國(guó)也受到消費(fèi)者追捧 [3]。
由于產(chǎn)地原因，我國(guó)的擬石蓮屬多肉植物，特別是罕見(jiàn)品種主要依賴從國(guó)外引進(jìn)，進(jìn)境數(shù)量逐年增加。另外，由于部分園藝愛(ài)好者不了解口岸檢疫相關(guān)法律法規(guī)，加之不法商家鋌而走險(xiǎn)，近年來(lái)，私自攜帶、郵寄等非法入境的擬石蓮屬植物逐年增多。非法入境的擬石蓮屬多肉植物雖然具有觀賞價(jià)值，但由于是活體植物，可以在國(guó)內(nèi)定殖，而目前國(guó)內(nèi)生態(tài)環(huán)境中缺乏能對(duì)其產(chǎn)生制約作用的天敵，造成生物入侵風(fēng)險(xiǎn)很高 [4]。未經(jīng)檢疫非法入境的活體植物及其栽培基質(zhì)極有可能攜帶昆蟲(chóng)蟲(chóng)卵、活蟲(chóng)、病毒、線蟲(chóng)和病原真菌等有害生物。相關(guān)報(bào)道顯示，已有交鏈孢霉、單齒線蟲(chóng)、莖線蟲(chóng)以及石蒜綿粉蚧等有害生物從截獲的多肉植物及其栽培土中被發(fā)現(xiàn) [5]，給我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境安全造成危害。
目前，擬石蓮屬多肉植物仍主要依賴形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行分類 [6]，但該屬各種植物葉形相似，葉色多變，形態(tài)學(xué)種類鑒定受制于鑒定人員的經(jīng)驗(yàn)與能力，因此亟待建立分子生物學(xué)鑒定方法作為補(bǔ)充。本研究以 DNA 條形碼(DNA barcoding)的方法，選用植物鑒定最常用的 DNA 條形碼 ITS 基因?yàn)檠芯繉?duì)象 [7]，利用該基因片段長(zhǎng)度適中、擴(kuò)增和測(cè)序效率高等特點(diǎn)，通過(guò)分析 ITS 基因的遺傳信息，精準(zhǔn)高效地對(duì)擬石蓮屬多肉植物進(jìn)行分類鑒定，填補(bǔ)國(guó)內(nèi)相關(guān)領(lǐng)域研究空白。
1 材料與方法
1.1 供試材料
共收集擬石蓮屬多肉植物 11 種，分別為綠爪、卡羅拉、麗娜蓮、吉娃娃、冰梅、苯巴蒂斯、碧桃、藍(lán)蘋(píng)果、火焰蒂亞、錦晃星、靜夜，所有供試材料均為口岸截獲的多肉植物活體植株。
1.2 樣本DNA提取及PCR擴(kuò)增
取樣本 30 g，加入適量液氮充分研磨，選用天根植物 DNA 提取試劑盒(TIANGEN DP305-03)提取樣本總 DNA。用引物ITS-F(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和 ITS-R(5'-CCGCAGGTTCACCTACGGA-3')進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增 [8]。PCR 反應(yīng)體系總體積 30 μL，其中，2×Emerald Amp Max PCR Master Mix 15 μL，上下游(F, R)引物各 2 μL，模板 DNA 2 μL，ddH2 O 補(bǔ)足剩余。
PCR 體系反應(yīng)條件：預(yù)變性，94℃ 5 min;變性， 94℃ 30 s， 退 火，56℃ 30 s， 延 伸，72℃ 30 s，35 個(gè)熱循環(huán);終延伸，72℃ 7 min;反應(yīng)結(jié)束，4℃ 保存。
使用 1% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳驗(yàn)證，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。
1.3 數(shù)據(jù)處理與分析
采用 SeqMan 軟件分析測(cè)序結(jié)果，手工矯正測(cè)序圖譜，去掉兩端引物區(qū)序列以及測(cè)序低質(zhì)量序列，拼接后獲得 ITS 基因目標(biāo)序列。運(yùn)用序列分析軟件 MEGA7(Molecular evolutionary genetics analysis)對(duì)拼接序列進(jìn)行多重序列比對(duì)分析和人工校驗(yàn)。基于 K2P(Kimura 2-Parameter)模型計(jì)算各物種種內(nèi)和種間 K2P 遺傳距離，運(yùn)用鄰接法(NJ 法)對(duì)所得序列分析結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。
2 結(jié)果分析
2.1 ITS基因種內(nèi)種間遺傳變異分析
擬石蓮屬 11 種 36 份供試樣本均擴(kuò)增得到 ITS 基因目的片段，雙向測(cè)序成功并完成了序列拼接。 11 種 36 份樣本的 ITS 基因序列長(zhǎng)度大小一致，為 651 ～ 654 bp，各種類之間 GC 含量差異不大，平均為 56.77%，見(jiàn)表 1。
基于 K2P 模型的遺傳距離分析表明，所有供試樣本 ITS 序列最小種間遺傳距離大于最大種內(nèi)遺傳距離。苯巴蒂斯和火焰蒂亞種內(nèi)變異最大，K2P 種內(nèi)遺傳距離均為 0.0063;種間遺傳距離最小的是錦晃星和靜夜，最小 K2P 種間遺傳距離為 0.0079，平均種間遺傳距離為 0.0095;種間遺傳距離最大的為碧桃和卡羅拉，最大 K2P 種間遺傳距離為 0.0594，平均種間遺傳距離為 0.0582。間隔區(qū)(Barcoding gap)圖顯示，各種類種內(nèi)遺傳距離明顯小于種間遺傳距離(表 2)，種內(nèi)遺傳距離與種間遺傳距離呈兩端分開(kāi)趨勢(shì)，兩者之間有明顯的間隔區(qū)，如圖 1 所示。
2.2 聚類分析
在基于 ITS 序列構(gòu)建的 NJ 樹(shù)中(圖 2)，NJ 樹(shù)各分支較長(zhǎng)，表明各種供試樣本 ITS 序列種間差異顯著，種類區(qū)分明顯。景天屬多肉植物漫畫(huà)湯姆作為外群?jiǎn)为?dú)為一支，與供試的擬石蓮屬多肉植物樣本差異顯著。供試的 11 種擬石蓮屬多肉植物各種之間能夠明確區(qū)分，36 個(gè)樣本按種類各自聚為一支，不同種類的樣本位于不同的分支，沒(méi)有物種聚類交叉，其中，苯巴蒂斯種內(nèi)變異最大，錦晃星與靜夜有相對(duì)較近的親緣關(guān)系，與 K2P 遺傳距離分析結(jié)果吻合。
3 討論
擬石蓮屬多肉植物因其外形似蓮花狀，葉色斑斕，花形獨(dú)特，還兼具品種多樣、不凋零的特質(zhì)而備受歡迎 [9]。但因我國(guó)在多肉植物雜交、育種方面研究較少，缺乏自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，中高檔、觀賞性強(qiáng)的多肉植物品種主要依賴進(jìn)口，致使部分品種價(jià)格居高不下。面對(duì)這一境況，部分商家和多肉愛(ài)好者選擇從境外購(gòu)買(mǎi)多肉植物，進(jìn)口量逐年增加。除正規(guī)途徑進(jìn)口外，私人夾帶、非法郵寄入境的現(xiàn)象日益嚴(yán)重，口岸檢疫風(fēng)險(xiǎn)逐年提高。目前國(guó)內(nèi)對(duì)擬石蓮屬多肉植物的分類鑒定仍依賴形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行鑒定分類，但由于水分、溫度等客觀環(huán)境因素的變化，擬石蓮屬多肉植物的葉色、株高等外觀特征會(huì)有十分明顯的變化，給形態(tài)鑒定造成很大困擾，不利于口岸檢疫人員進(jìn)行分類鑒定。本研究利用 ITS 基因作為 DNA 條形碼基因進(jìn)行分子鑒定，利用其變異足夠、易擴(kuò)增且 DNA 片段相對(duì)較短的特點(diǎn) [10]，建立擬石蓮屬多肉植物的精準(zhǔn)分子分類鑒定新方法，可以消除由于外部環(huán)境變化導(dǎo)致植株外觀形態(tài)變化給分類鑒定帶來(lái)的困擾，為針對(duì)非法入境多肉植物進(jìn)行快速準(zhǔn)確的鑒定、歸類提供可能。
多 篇 研 究 論 文 結(jié) 果 表 明， 除 ITS 基 因 外， matk6、ropB、rpoC1、rbcL、psbA-trnH 等基因可以作為備選基因進(jìn)行植物條形碼鑒定 [6,8]，本文作者也就這幾個(gè)基因?qū)M石蓮屬多肉植物進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示 matk6 基因擴(kuò)增效率很低，不適合作為擬石蓮屬多肉植物條形碼基因。另外 4 個(gè)基因 ropB、rpoC1、 rbcL 和 psbA-trnH 擴(kuò)增和測(cè)序效率較好，但序列比對(duì)結(jié)果顯示ropB、rbcL、rpoC1 3 個(gè)基因都非常保守，種內(nèi)種間遺傳變異無(wú)明顯差異，不適合作為 DNA 條形碼基因進(jìn)行分析;psbA-trnH 遺傳變異較大，但無(wú)法用這一個(gè)基因區(qū)分供試的 11 個(gè)物種。只有 ITS 基因種內(nèi)種間遺傳變異明顯，有良好的種類區(qū)分效果，研究結(jié)果與本文作者對(duì)景天屬多肉植物的研究結(jié)果一致 [8]。最終結(jié)果表明，幾個(gè)備選基因中，只有 ITS 基因最適合作為條形碼基因鑒定擬石蓮屬多肉植物，該基因可以準(zhǔn)確區(qū)分供試樣本各個(gè)物種，種內(nèi)種間變異差異明顯，且不同批次樣本鑒定結(jié)果穩(wěn)定。未來(lái)還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，對(duì) ITS 基因作為 DNA 條形碼基因的通用性進(jìn)行進(jìn)一步研究。
DNA 條形碼技術(shù)通過(guò)分析植物特定基因的遺傳變異信息對(duì)植物進(jìn)行精準(zhǔn)的物種鑒定，對(duì)復(fù)雜的隱存類群也有很好的分辨效果。目前有海量的植物 DNA 序列信息存儲(chǔ)于 GeneBank 等數(shù)據(jù)庫(kù)中，但有很多 DNA 序列欠缺具體的標(biāo)本描述，甚至分類鑒定結(jié)果源于錯(cuò)誤的形態(tài)學(xué)分類依據(jù)，因此 DNA 條形碼技術(shù)在植物種類鑒定領(lǐng)域的應(yīng)用受到制約。未來(lái)的研究需要在數(shù)據(jù)庫(kù)中添加大量的模式植物及其衍生植物樣本的基因序列，才能有效提高 DNA 條形碼技術(shù)在植物物種鑒定領(lǐng)域的適用性和準(zhǔn)確性。
4 結(jié)論
K2P 遺傳距離結(jié)果證明，ITS 序列可以作為條形碼基因?qū)┰嚨?11 種多肉植物做快速分子鑒定。分析 ITS 構(gòu)建的 NJ 樹(shù)結(jié)果顯示，ITS 序列對(duì)擬石蓮屬各種供試多肉植物有很好的聚類效果，ITS 可以作為供試 11 種擬石蓮屬多肉植物的 DNA 條形碼序列。——論文作者：姜 一1 王仲敏1 劉 勇1 賀 艷1 高 建1 廖 芳1*
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