發(fā)布時間：2021-09-30所屬分類：農(nóng)業(yè)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘 要：目的：評定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量的不確定度。方法：依據(jù)《糧油檢驗主要谷物中16種真菌毒素的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》(LS/T61332018)進(jìn)行實驗，按照《測量不確定度評定與表示》(JJF1059.12012)分析測定過程的不
摘 要：目的：評定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量的不確定度。方法：依據(jù)《糧油檢驗主要谷物中16種真菌毒素的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》(LS/T6133—2018)進(jìn)行實驗，按照《測量不確定度評定與表示》(JJF1059.1—2012)分析測定過程的不確定度來源，建立數(shù)學(xué)模型計算合成不確定度和擴展不確定度。結(jié)果：小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量為1930μg/kg，其擴展不確定度256μg/kg(P=95%，k=2)。結(jié)論：影響本次測定過程的不確定度主要包括重復(fù)檢測、標(biāo)準(zhǔn)溶液純度及配制、樣品制備、DON同位素內(nèi)標(biāo)和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。儀器引入的不確定度分量對本次評定影響最大。
關(guān)鍵詞：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀;不確定度
真菌毒素廣泛的存在于食品和飼料中，全球都普遍面臨著真菌毒素污染的重大問題，嚴(yán)重威脅著人類和動物的生命安全[1-2]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)是一種是單端孢霉烯族毒素，具有較強的熱抵抗力和耐酸性[3]，食用了DON污染的食物后，可對人和動物的腸道、大腦及神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生毒害作用，使動物產(chǎn)生厭食和嘔吐反應(yīng)等急性中毒癥狀[4]，嚴(yán)重時損害造血系統(tǒng)造成死亡[5-7]，因此DON又稱嘔吐毒素[8-11]。
測量不確定度是表征合理地賦予被測量之值的分散性，與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)。測量不確定度通常包括很多分量[12]。其中一些分量是具有統(tǒng)計性的，另一些分量是具有非統(tǒng)計性的。為得到準(zhǔn)確、可靠和科學(xué)的實驗數(shù)據(jù)，不確定度的評定具有重要作用。DON含量的定量分析結(jié)果應(yīng)包括測量值和測量不確定度，能更準(zhǔn)確地反映脫氧雪腐鐮刀烯醇的濃度。本次實驗采用《糧油檢驗主要谷物中16種真菌毒素的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》(LS/T6133—2018)[13]測定小麥中DON的含量，參照《測量不確定度評定與表示》(JJF1059.1—2012)[14]，建立DON不確定度的評定方法，分析在檢測過程中產(chǎn)生的不確定度分量[15-16]，對各分量進(jìn)行計算得到合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度、擴展不確定度，以及各分量的相對貢獻(xiàn)，能夠為更準(zhǔn)確、科學(xué)的評定檢測結(jié)果提供依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 儀器與試劑
1290-6460超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Agilent公司);DT300A百分之一分析天平(江蘇省意歐儀器儀表有限公司);3-18ks離心機(德國Sigma公司);C18色譜柱(Agilent公司，100mm×2.1mm，1.8μm)。
DON標(biāo)準(zhǔn)液濃度(濃度為100.6μg/mL，不確定度為1.2μg/mL，Pribolab公司);13C15-脫氧雪腐鐮刀烯醇同位素內(nèi)標(biāo)(13C15-Deoxynivalenol，13C15-DON，濃度為25μg/mL，不確定度為0.2μg/mL，Pribolab公司);乙腈、甲醇、乙酸銨、乙酸(分析純，美國Merck公司)。
樣品提取液：乙腈-水-乙酸混合液(70︰29︰1，V︰V︰V，自行配制)。
1.2 實驗方法
1.2.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀色譜條件
儀器條件柱溫35℃;進(jìn)樣量：1μL;流速：0.20mL/min;流動相：A為1%乙酸溶液和5mmol/L乙酸銨的水溶液，B為甲醇;流動相梯度洗脫條件見表1。
1.2.2 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀質(zhì)譜條件
電離模式：電噴霧電離源(ESI)負(fù)離子模式;毛細(xì)管電壓：4kV(+)，3.5kV(-);脫溶劑氣溫度：350℃;脫溶劑流量：10L/min;碰撞氣體：氬氣;掃描模式(scantype)：多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM);駐留時間：30ms，質(zhì)譜條件參數(shù)見表2。
1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋液為乙腈-水-乙酸(35︰64.5︰0.5，V︰V︰V)混合液。
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100.6μg/mL的DON標(biāo)準(zhǔn)液配制得到10μg/mL的DON標(biāo)準(zhǔn)儲備液，然后經(jīng)過稀釋得到1.5μg/mL的DON標(biāo)準(zhǔn)工作液，稀釋1.5μg/mL的DON標(biāo)準(zhǔn)液得到一系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液，濃度分別為37.5μg/mL、75μg/mL、150μg/mL、375μg/mL和1500μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取0.8mL的13C15-DON內(nèi)標(biāo)液于10mL容量瓶中，定容至刻度線，得到2μg/mL的13C15-DON同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液。
1.2.4 樣品前處理
粉碎小麥樣品，過500μm孔徑試驗篩，混勻。準(zhǔn)確稱取5g(精確到0.01g)小麥樣品于50mL離心管，加入20mL提取液，渦旋或振蕩提取30min，然后用離心機6000r/min離心10min，吸取0.5mL上清液于1.5mL離心管中，加入0.5mL超純水，旋渦混勻，在4℃以下12000r/min離心10min，上清液過0.2μm的聚四氟乙烯濾膜，收集濾液A。
1.2.5 添加13C15-DON同位素內(nèi)標(biāo)液
準(zhǔn)確吸取180μL濾液A或者標(biāo)準(zhǔn)系列工作曲線于進(jìn)樣小瓶中，加入20μL之前配制好的13C15-DON同位素內(nèi)標(biāo)工作液，旋渦混勻，上機待測。
2 結(jié)果與分析
2.1 測量不確定度的來源分析
根據(jù)CNAS-GL006-2019化學(xué)分析中不確定度的評估指南，上述數(shù)學(xué)模型和檢測方法操作步驟，測定小麥中DON的不確定度來源于以下幾個方面：待測樣品檢測重復(fù)性引入的不確定度;標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作液配制過程引入的不確定度;標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作液擬合產(chǎn)生的不確定度;樣品制備前處理過程中引入的不確定度;內(nèi)標(biāo)引入的不確定度;檢測方法及儀器設(shè)備引入的不確定度。
2.2 各不確定度分量的分析和評定
2.2.1 重復(fù)檢測引入的不確定度評定
重復(fù)檢測引入的不確定度屬于A類不確定度。實驗室日常檢測，無法將所有的樣品進(jìn)行前處理，這就會引起檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確，因此只能通過混勻粉碎混勻，盡量確保樣品的均勻性，增加檢驗次數(shù)，盡量減少樣品的不均勻性引起的實驗誤差。為了評定重復(fù)性檢測的不確定度分量，分別稱取6份小麥樣品，經(jīng)過前處理上機檢測計算得到質(zhì)控樣品的濃度，結(jié)果見表3。
2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度評定標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度來源主要包括標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度、配置系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液時產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度、不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。
由表4可知，儀器引入的不確定度相對貢獻(xiàn)最大，其次是配制標(biāo)曲、樣品前處理過程、重復(fù)性檢測、同位素內(nèi)標(biāo)引入的不確定度，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合引入的不確定度最小。
取置信水平為95%，k=2，因此擴展不確定度為U=k×u×c=2×0.06640×1930=256ug/kg。高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀內(nèi)標(biāo)法測定小麥中DON的含量結(jié)果為(1930±256)μg/kg(k=2)。
3 結(jié)論
高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀內(nèi)標(biāo)法測定小麥中DON含量的不確定度評定最終結(jié)果表示為(1930±256)μg/kg(k=2)，擴展不確定度為256μg/kg。本次測定過程的不確定度分量中，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀引入的不確定度分量為0.05500，對合成不確定度的影響最大，其次是配制標(biāo)曲、樣品前處理過程、重復(fù)性檢測、同位素內(nèi)標(biāo)引入，而標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合引入的不確定度分量為對結(jié)果的影響最小。——論文作者：袁 夢，胡 莎，葛文靜
