鹵鴨脖中優勢腐敗茵和致病菌的分離與鑒定

發布時間：2020-04-24所屬分類：農業論文瀏覽：1374次

摘 要： 摘要通過傳統平板培養和16SrDNA擴增測序相結合的方法，對武漢某熟食企業鴨脖中優勢腐敗菌進行初步分析，為食品的保藏提供參考依據。結果表明鹵鴨脖中的優勢腐敗菌主要為巴黎鏈球茵和大腸艾希氏菌。它們可能是造成鴨脖腐敗的主要原因。采用選擇性培養基富集培

　　摘要通過傳統平板培養和16SrDNA擴增測序相結合的方法，對武漢某熟食企業鴨脖中優勢腐敗菌進行初步分析，為食品的保藏提供參考依據。結果表明鹵鴨脖中的優勢腐敗菌主要為巴黎鏈球茵和大腸艾希氏菌。它們可能是造成鴨脖腐敗的主要原因。采用選擇性培養基富集培養后，提取DNA，進行PCR擴增，檢測沙門氏菌、大腸桿菌0157、單核細胞增生李斯特氏茵、副溶血弧茵、金黃色葡萄球菌等致病菌，檢出結果均為陰性。采用平板分離可檢出肺炎克雷伯氏菌。

　　關鍵詞鴨脖優勢腐敗茵致病茵16SrDNA—PCR平板分離

　　鴨肉以高蛋白、低脂肪、低膽固醇等特點而被列為首選的動物“健康食品”。鴨肉的營養價值很高，可食部分中的蛋白質含量約為16%～25%，比畜肉含量高得多J。鹵鴨脖作為鹵制品中的代表，營養豐富并具有獨特的風味和口感，越來越受到消費者青睞。但在其制作加工的過程中易受到微生物的污染，容易引發食品安全事故，給消費者的健康造成危害_2J。我們采用16SrDNA擴增測序和傳統平板分離方法，對武漢市售鴨脖的優勢腐敗菌進行初步分析，同時采用國標法PCR擴增檢測主要致病菌，為其質量控制提供參考依據。

　　1材料與方法

　　1.1試劑與材料

　　DNAmarker、ExTaqDNA聚合酶、PCR產物純化試劑盒、GoldView核酸染料、PCA、MRS、新生霉素、CHRO等選擇性培養基和添加劑。

　　大腸桿菌0157：H7、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、副溶血弧菌等標準菌株，均由武漢市疾病控制中心提供。金黃色葡萄球菌由本課題組保存

　　1.2儀器與設備

　　SW—CJ—IBV超凈工作臺;TGRADIENTPCR儀;GBOX—H12一E—M自動凝膠成像分析系統;DYY一2C電泳儀;臺式高速冷凍離心機;HMB一400B拍擊式均質器。

　　1.3方法

　　1.3.1增茵

　　在無菌操作條件下將鹵鴨樣品切成小塊，分別稱取25g切碎的樣品放入無菌均質袋，在拍擊式均質器下處理5—8min，將混合液分別轉入PCA、MRS、EC增菌液等液體培養基，150r/min、37~(2搖床振蕩12h培養。

　　1.3.2涂平板

　　取上述增菌后的菌懸液用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，從1O稀釋到1O～，取10一、10～、l0三個梯度，分別涂PCA和MRS瓊脂平板，每個梯度涂兩個平板，培養后挑取不同形態的細菌進行革蘭氏染色、顯微觀察。

　　1.3.3DNA提取

　　SDS一酶裂解法提取DNAl3J。取1mL菌液室溫下8000r/min離心5min。棄上清，將沉淀重新懸浮于lmLTE緩沖液中。加人201.~L的溶菌酶(50mg/mE)，37℃保溫1.5h。再加入(5mol/L)NaC150txL，10%SDS1IOI~L，(20mg/mL)蛋白酶K3txL，55cI=保溫50min后冰上放置。加入5IxLRNA酶室溫放置30min，直至混合菌液變為透明粘稠液體。將菌液等量分裝到2個1.5mLEP管中，每管再加入等體積的苯酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)，混勻后12000r/min、4離心10min。取上清，再用苯酚：氯仿：異戊醇抽提2次。取上清加人0.6倍體積的異戊醇(一20℃預冷)，混勻后12000r/min離心10min。用75%乙醇洗滌DNA沉淀。晾干后，將DNA溶于50txLTE緩沖液中。

　　1.3.416SrDNAPCR擴增

　　本實驗采用文獻報道的細菌通用引物對_4]。上游弓l物為：5一AGAGrIvITrGATCCTGGCTCAG一3。下游引物為：5一AAGGAGGTGATCCAGCC一3。預期PCR產物大小為1600bp左右。

　　PCR體系為：10xbuffer5.01xL，dNTP4.0，上下游引物各1.0L，模板1.0L，ExTaqDNA聚合酶0.5txL，補ddH2O至501xL。

　　PCR反應條件：94~C預變性5min;94cI=45s，55℃45s，72℃1.5rain，循環擴增3O次;72~C10min。取5IxLPCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

　　1.3.5PCR產物純化與測序分析

　　PCR產物用PCR產物純化試劑盒純化后，送生工生物工程(上海)有限公司武漢測序部雙向測序。

　　1.3.6比對

　　用DNAstar軟件將測序得到的16SrDNA基因序列進行拼接，得到16SrDNA序列，提交到NCBIGenBank數據庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)進行序列比對。

　　1.3.7致病菌檢測

　　將增菌后的菌液提取DNA，按國標法進行PCR擴增，檢測大腸桿菌O157：H7、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌。

　　2結果與分析

　　2.1平板分離與培養

　　我們在2011年7月和9月間從不同門店購買同一品牌市售鹵鴨脖，增菌后進行平板分離培養。其中可得到三種類型的細菌。一種在平板上的菌落為較小的圓形，邊緣整齊，顏色為白色。革蘭氏染色后為紫色，球形鏈狀排列。將其分離菌株命名為菌株1。一種在平板上的菌落為較大的圓形，邊緣整齊，顏色為淺黃色。革蘭氏染色后為紅色，桿狀，呈短鏈狀排列。將其分離菌株命名為菌株2。一種在平板上菌落為較小圓形，邊緣整齊，顏色為淺黃色，革蘭氏染色為紅色，桿狀，生理生化實驗驗證為大腸艾希氏菌。

　　2.216SrDNAPCR擴增與測序

　　將分離到的菌株1和菌株2的單菌落，培養后提取DNA進行16SrDNAPCR擴增(圖1)。將PCR產物純化后，送生物公司進行雙向測序。將測序結果在NCBIGenBank數據庫進行比對分析，菌株1與NCBI參考序列(如FJ611790)最大相似度為99%，判定為巴黎鏈球菌(Streptococcuslutetiensis)。菌株2與NCBI參考序列(如CP002910)最大相似度為99%，判定為肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)。

　　2.3致病菌檢測

　　采用各種選擇性培養基針對性培養富集后，將樣品提取DNA，按國標法進行PCR擴增。分析方法和檢測結果見表1。

　　3討論

　　采用微生物常規培養技術分離、鑒定腐敗細菌，耗時長。在鹵鴨腐敗菌研究中采用分子生物學檢測技術，不失為一種快速準確的方法。本文通過16SrDNA~J]序和傳統平板分離培養相結合的方法分析了鹵鴨脖中優勢腐敗菌，結果表明某品牌鹵鴨脖中的優勢腐敗菌為巴黎鏈球菌和大腸艾希氏菌。兩種細菌均為主要腐敗菌，但比例呈現一定消長變化。7月份時武漢的平均溫度大概為37℃，溫度較高，此時鹵鴨脖中的優勢腐敗菌主要為大腸艾希氏菌。9月份時武漢市的平均氣溫為30~C，溫度較7月有所下降，此時鴨脖中的優勢腐敗菌主要為巴黎鏈球菌。本文采用MRS培養基多次培養均未分離到乳酸菌，可能乳酸菌在鹵鴨脖總菌相中不占主要地位。

　　采用選擇性培養基富集培養后，提取DNA，進行PCR擴增，檢測沙門氏菌、大腸桿菌0157、單核細胞增生李斯特氏菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌等致病菌，檢測結果均為陰性。但采用平板分離意外檢出了肺炎克雷伯氏菌。說明生產企業和銷售門店仍需加強環境消毒措施，控制致病菌的污染。

　　鹵鴨脖經過高溫鹵制、殺菌工藝，能有效殺滅鹵鴨脖中的絕大部分微生物，此時細菌菌群比較單一。本文初步確定了某品牌鹵鴨脖中的優勢腐敗微生物，旨在幫助企業采取有效的加工工藝，強化食品的質量控制，為食品的保藏方法提供參考依據。

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