發(fā)布時(shí)間：2020-04-24所屬分類：農(nóng)業(yè)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要:目的調(diào)查分析云南省一例唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)食物中毒事件。方法參照GB/T4789.29-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)椰毒假單胞菌酵米面亞種檢驗(yàn)》對(duì)樣品進(jìn)行唐菖蒲伯克霍爾德氏菌檢測(cè)。按照GB5009.189-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中
摘要:目的調(diào)查分析云南省一例唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)食物中毒事件。方法參照GB/T4789.29-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)椰毒假單胞菌酵米面亞種檢驗(yàn)》對(duì)樣品進(jìn)行唐菖蒲伯克霍爾德氏菌檢測(cè)。按照GB5009.189-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中米酵菌酸的測(cè)定》檢測(cè)樣品中的米酵菌酸,采用液相色譜法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。用VITEK2COMPACT全自動(dòng)微生物生化鑒定儀和飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行微生物鑒定。結(jié)果2份樣品鑒定結(jié)果為唐菖蒲伯克霍爾德菌。2份樣品均檢測(cè)出米酵菌酸,含量分別為18.0和24.2mg/kg。結(jié)論本次食物中毒源于食源性唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)污染。
關(guān)鍵詞:唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種);食物中毒;米酵菌酸
1引言唐菖蒲伯克霍爾德氏菌Burkholderiagladioli(椰毒假單胞菌酵米面亞種,PseudomonascocovenenanssubtypeFarinofermentans)簡(jiǎn)稱椰酵假單胞菌,是谷物發(fā)酵品、變質(zhì)銀耳及薯類制品食物中毒的病原菌[1,2]。椰毒假單胞菌酵米面亞種在1999年被劃為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的一個(gè)病原型[3]。該菌引起的食物中毒平均死亡率達(dá)41.80%,個(gè)別中毒事件中死亡率高達(dá)100%,是迄今我國(guó)病死率極高的一種細(xì)菌性食物中毒。1977年黑龍江從臭米面食品中發(fā)現(xiàn)椰酵假單胞菌,證實(shí)該菌產(chǎn)生的毒素米酵菌酸是引起食物中毒和死亡的主要毒性代謝產(chǎn)物[4]。近幾年,由椰酵假單胞菌引起的食物中毒在云南偶有發(fā)生,發(fā)生地多為偏遠(yuǎn)、經(jīng)濟(jì)相對(duì)落后的地方,以受污染的糯米湯圓粉及吊漿面為主[5,6]。2013年云南省紅河州發(fā)生過(guò)吊漿粑引起的聚集性的食物中毒事件,死亡5人[7]。2014年云南省文山州發(fā)生一起由湯圓引起的食物中毒,死亡6人[8]。2起由椰酵假單胞菌中毒致人死亡的事件中,給家庭造成了重大損失,給社會(huì)帶來(lái)了極大影響。
本研究采用快速和傳統(tǒng)方法檢測(cè)現(xiàn)場(chǎng)采樣的玉米面粉中的椰毒假單胞菌,同時(shí)采用高效液相色譜法對(duì)樣品中的椰毒假單胞菌產(chǎn)生的毒素米酵菌酸進(jìn)行了測(cè)定,以期為我國(guó)唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)食物中毒快速鑒定提供科學(xué)依據(jù)。
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2材料與方法
2.1材料與儀器
2.1.1樣品
未食用生吊漿面2份。該樣品來(lái)自2018年6月2日云南省文山州廣南縣黑支果鄉(xiāng)馬稍村委會(huì)梁子上小組發(fā)生一起家庭聚集性食物中毒事件,中毒人數(shù)3人,死亡2人。中毒食物為包谷面粉自制的吊漿靶面湯圓,中毒者出現(xiàn)頭暈、眼花、惡心、嘔吐、腹痛等癥狀,疑為椰毒假單胞菌食物中毒。廣南縣疾病預(yù)防控制中心現(xiàn)場(chǎng)采集可疑吊漿面送到云南省疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢驗(yàn)。
2.1.2培養(yǎng)基
馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA平板(英國(guó)Oxoid公司);GVC增菌液(廣東環(huán)凱股份有限公司);卵黃瓊脂(北京陸橋技術(shù)公司);自制改良PDA中添加龍膽紫(1:100000,V:V)和氯霉素水溶液(終濃度為20μg/mL)。
2.1.3主要儀器
VITEK2COMPACT全自動(dòng)微生物生化鑒定儀(法國(guó)梅里埃公司);AutoflexSpeed基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜微生物鑒定儀(德國(guó)布魯克公司);1290超高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司);BD240生化培養(yǎng)箱(日本Binder公司)。
2.2實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1分離鑒定方法
按照GB/T4789.29-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)椰毒假單胞菌酵米面亞種檢驗(yàn)》[9]中規(guī)定的方法進(jìn)行增菌、平板分純,用VITEK2COMPACT全自動(dòng)微生物生化鑒定儀和飛行時(shí)間質(zhì)譜微生物鑒定儀(automaticmicrobialbiochemicalidentificationinstrument-time-of-flightmassspectrometer,MALDI-TOF)進(jìn)行鑒定。
2.2.2米酵菌酸測(cè)定
米酵菌酸檢測(cè)參考方法為GB5009.189-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中米酵菌酸的測(cè)定》[10],采用高效液相色譜法對(duì)樣品開(kāi)展米酵菌酸毒素檢測(cè)。
儀器條件為色譜柱:AgilentC18柱(4.6mm×250mm,5μm)不銹鋼柱;流動(dòng)相:甲醇:水(75:25,V:V),水用冰乙酸調(diào)pH至2.5;檢測(cè)器:指二極管陣列檢測(cè)器(diodearraydetector,DAD)波長(zhǎng)267nm;流速:1.0mL/min;柱溫:30℃。
2.2.3實(shí)驗(yàn)方法
稱取一定量的粉末(精確至0.0001g)樣品,置于錐形瓶中,加入100mL甲醇-氨水溶液,混勻,室溫下避光浸泡1h,置于超聲波震蕩提前30min,過(guò)濾。置80℃水浴中濃縮至3mL。
試樣的凈化:將濃縮后的試樣全部轉(zhuǎn)移到已經(jīng)活化的固相萃取柱(陰離子交換柱60mg/3mL或等效品)中,依次用5mL水和5mL甲醇淋洗,棄去流出液,抽干萃取柱,用6mL甲酸-甲醇液洗脫,收集洗脫液,于40℃水浴中氮吹至干,然后加入1mL甲醇,混勻,經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行高效液相色譜分析。上機(jī)測(cè)定,據(jù)保留時(shí)間定性,外標(biāo)峰面積法定量。
3結(jié)果與分析
3.1分離鑒定結(jié)果
3.1.1快速分離法
2份樣品(吊漿面)稀釋后直接涂布在改良PDA平板,37℃培養(yǎng)24h后,各種雜菌生長(zhǎng),包括酵母也生長(zhǎng)。挑取紫色或者中心顏色深,周邊顏色淺,濕潤(rùn),邊緣整齊的可疑菌落直接用飛行時(shí)間質(zhì)譜微生物鑒定儀鑒定。結(jié)果鑒定為唐菖蒲伯克霍爾德菌(Burkholderiagladioli)。唐菖蒲伯克霍爾德菌MALDI-TOF鑒定分值為2.225。唐菖蒲伯克霍爾德菌標(biāo)準(zhǔn)菌株與樣品比對(duì)圖譜見(jiàn)圖1。
3.1.2傳統(tǒng)分離法
按照GB/T4789.29-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)椰毒假單胞菌酵米面亞種檢驗(yàn)》[9],將樣品加入GVC增菌液增菌48h后,劃線接種PDA平板和改良PDA平板培養(yǎng)24h,PDA平板上形成的可疑菌落大小約1~1.5mm,呈灰白色、濕潤(rùn)、表面光滑、邊緣整齊。改良PDA平板上形成的可疑菌落呈紫色或者中心顏色深,周邊顏色淺,濕潤(rùn),邊緣整齊。挑取可疑單個(gè)菌落,接種卵黃瓊脂平板。在卵黃瓊脂平板上,可見(jiàn)形成表面光滑及濕潤(rùn)的菌落。置36℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48h后,菌落周圍形成乳白色混濁環(huán),對(duì)日光斜視可見(jiàn)環(huán)表面呈明顯虹彩現(xiàn)象。
3.1.3生化試驗(yàn)
將可疑菌接種PDA斜面置(36±1)℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h,挑取少量菌苔,做相關(guān)生化實(shí)驗(yàn),動(dòng)力+,氧化酶-,靛基質(zhì)-,V-P,-O/F試驗(yàn)(O型)+,葡萄糖-,果糖-,半乳糖-,阿拉伯糖-,甘露醇+,硝酸鹽還原+,尿素-,側(cè)金盞花醇-,檸檬酸鹽利用+,精氨酸+,5℃和41℃不生長(zhǎng)(+表示陽(yáng)性結(jié)果,-表示陰性結(jié)果)。VITEK2COMPACT鑒定結(jié)果為唐菖蒲伯克霍爾德菌。
3.2米酵菌酸測(cè)定
采用液相色譜法對(duì)樣品開(kāi)展椰酵假單胞菌產(chǎn)生的米酵菌酸毒素檢測(cè),從送檢的2份樣品中均檢出了米酵菌酸。2份樣品的含量分別為18.0和24.2mg/kg。米酵菌酸色譜圖見(jiàn)圖2。參考GB7096-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食用菌及其制品》,米酵菌酸含量必須≤0.25mg/kg[11],檢出的樣品中米酵菌酸含量均遠(yuǎn)高于此標(biāo)準(zhǔn)。
4結(jié)論與討論
本次中毒事件檢測(cè)中,采用傳統(tǒng)方法與快速檢測(cè)方法的結(jié)合,最大程度保證目標(biāo)菌不被漏檢,互相驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究采用的快速分離法[12]是本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)椰酵假單胞菌檢測(cè)經(jīng)驗(yàn),對(duì)PDA培養(yǎng)基進(jìn)行改良,分別加入龍膽紫和氯霉素水溶液,使培養(yǎng)基選擇性更強(qiáng),菌落特征顯著,利于鑒別。通過(guò)直接涂布在改良的PDA平板上,酵母少量生長(zhǎng),目標(biāo)菌明顯。挑取可疑菌落用飛行時(shí)間質(zhì)譜微生物鑒定儀鑒定,幾分鐘內(nèi)即可得到鑒定結(jié)果,整個(gè)鑒定過(guò)程僅需要24h。這與傳統(tǒng)增菌-選擇性培養(yǎng)基分離-生化鑒定的方法需要5~6d時(shí)間相比,節(jié)約了大量的時(shí)間,操作簡(jiǎn)便,準(zhǔn)確性高,可以較早、較好地得到檢驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)按傳統(tǒng)方法進(jìn)行分離,通過(guò)生化試驗(yàn),也分離到椰酵假單胞菌。2種方法結(jié)合,保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
本研究中,利用VITEK2COMPACT全自動(dòng)微生物生化鑒定儀和飛行時(shí)間質(zhì)譜微生物鑒定儀鑒定,其結(jié)果為唐菖蒲伯克霍爾德菌(Burkholderiagladiol)。椰酵假單胞菌和唐菖蒲伯克霍爾德菌致病型菌株的典型株在生化特征上差異極微。比較椰酵假單胞菌16SrRNA基因序列后,根據(jù)細(xì)菌的系統(tǒng)分類將其劃歸為唐菖蒲伯克霍爾德菌的一個(gè)病原型,還建議劃分椰酵假單胞菌米酵菌酸產(chǎn)毒株及不產(chǎn)毒株為唐菖蒲伯克霍爾德菌的一個(gè)或幾個(gè)生物變種或新的生物型。說(shuō)明椰酵假單胞菌和唐菖蒲伯克霍爾德菌致病型菌株的典型株在生化特征上差異很小,支持了椰酵假單胞菌與唐菖蒲伯克霍爾德菌更為近緣這一結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果跟上述研究報(bào)道一致[13-15],椰酵假單胞菌即唐菖蒲伯克霍爾德菌。
本次中毒事件中,實(shí)驗(yàn)室間采用微生物快速檢測(cè)椰毒假單胞菌與高效液相色譜法2種方法相結(jié)合檢測(cè)主要代謝產(chǎn)物米酵菌酸,同時(shí)對(duì)中毒樣品的毒物進(jìn)行了確認(rèn)。采用理化檢測(cè)技術(shù)手段與微生物檢測(cè)技術(shù)手段相結(jié)合的方法,用不同方法相互印證,保證了突發(fā)性公共衛(wèi)生中毒事件中毒物檢測(cè)的準(zhǔn)確性,為緊急醫(yī)療救治方案提供更佳合理、可靠的實(shí)驗(yàn)室支持。同時(shí)為將來(lái)的酵米面中毒突發(fā)公共衛(wèi)生應(yīng)急處置提供實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的技術(shù)依據(jù)。
對(duì)本次中毒事件的分析鑒定,為相關(guān)部門中毒事件應(yīng)急處置采取及時(shí)有效的控制措施提供科學(xué)依據(jù),同時(shí)為有效控制食源性疾病的發(fā)生、流行提供技術(shù)支持。針對(duì)近幾年在云南由椰酵假單胞菌產(chǎn)生的毒素所引起的食物中毒時(shí)有發(fā)生,提供以下建議:一是加強(qiáng)對(duì)重點(diǎn)地區(qū)食品安全的監(jiān)督和宣傳:不用霉變的玉米、糯米等制備酵米面,保持衛(wèi)生,儲(chǔ)存放置地點(diǎn)要通風(fēng)防潮;二是建立和完善食品安全污染源及食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò),為國(guó)家及地方食源性疾病的監(jiān)測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。
