超高效液相色譜-串聯質譜法分析沿海貝類產品中的麻痹性貝毒

發布時間：2020-03-14所屬分類：農業論文瀏覽：1267次

摘 要： 摘要：采用一種同時檢測13種麻痹性貝毒的超高效液相色譜-串聯質譜法，對沿海7省的貝類產品進行分析。目標物采用1Q乙酸水溶液提

　　摘要：采用一種同時檢測13種麻痹性貝毒的超高效液相色譜-串聯質譜法，對沿海7省的貝類產品進行分析。目標物采用1Q乙酸水溶液提取、石墨化碳黑固相萃取柱凈化，氨基柱分離，多反應監測模式檢測，外標法定量#方法檢出限為4〜14#g/kg，回收率為60〜105%，日內和日間相對標準偏差分別為3!16Q和5〜17%(n=3"所檢6種99批次的貝類產品中，麻痹性貝毒在貽貝、泥蚶、毛蚶、扇貝中檢出率分別達38.89%、23.53%、23.08%、1667Q，其毒力水平在669!1635.5#gSTXeq/kg之間。

　　關鍵詞：貝類產品麻痹性貝毒固相萃取超高效液相色譜-串聯質譜法

　　麻痹性貝毒(paralyticshellfishpoisonings，或其孢子，經食物鏈蓄積、轉化生成的一類四氫曝PSP)是由海洋中貝類通過非選擇性濾食有毒海藻呤衍生物[1]。在多種貝類毒素中，PSP危害最大、發生頻率最高、分布范圍最廣，嚴重威脅人類健康2#聯合國衛生組織規定貝類可食用部分的PSP含量不得超過800#gSTXeq/kg[3]。

　　相關期刊推薦：《分析儀器》(雙月刊)創刊于1970年，由中國儀器儀表行業協會和北京分析儀器研究所(北京北分儀器技術公司)主辦，國內外公開發行。本刊主要反映分析儀器和儀器分析技術的發展動態;報導分析儀器科研成果、新型儀器和儀器的改進;探討分析儀器和儀器分析的有關理論;推廣分析儀器的應用技術;交流分析儀器使用和維修經驗;介紹分析儀器和儀器分析方法的基礎知識等。

　　目前PSP測定方法主要有小鼠生物法、ELISA法、細胞毒性測試法、毛細管電泳法[4]、液相色譜法[5]和液質聯用法[6]。小鼠生物法無法定量毒素組分，ELISA法易產生假陽性，細胞毒性測試法難以迅速普及，毛細管電泳法適用性有限，液相色譜法前處理復雜。液質聯用法可同時提供定性定量信息，已廣泛應用于動物及環境中PSP的監測。本研究以超高效液相色譜-串聯質譜法(ultraperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry,UPLG-MS/MS)為分析手段，對沿海省份6類共99批次貝類產品中13種PSP進行了監測，為了解PSP在食用貝類中的污染和分布情況提供數據支持。

　　1材料與方法

　　1.1材料與試劑

　　扇貝、貽貝、牡蠣等貝類產品，購買于沿海各省市的流通市場和養殖區;PSP標準品購買于加拿大海洋生物科學研究所;乙酸：優級純，上海國藥集團;氨水：色譜純，上海沃凱生物技術有限公司;乙腈：色譜純，德國Meker公司;甲酸：色譜純，上海國藥集團。

　　12儀器與設備

　　ACQUITY超高效液相色譜-質譜儀(美國Water公司);石墨化碳黑固相萃取柱(250mg/3mL,美國Supelco公司);Centrifuge5810高速離心機(德國Eppendorf公司)。

　　13方法

　　1.3.1樣品處理

　　樣品前處理參考文獻[7]:稱取5g均質試樣于50mL離心管中，加人5mL1Q乙酸水溶液，渦旋混合90s，密封置于沸水浴5min，取出于流水冷卻至室溫。混合物4500r/min離心10min,取上清液1mL于2mL離心管中，加人5#L氨水，渦旋混勻后10000r/mtn離心5mtn。

　　依次用3mL乙腈、3mL20Q乙腈水溶液(含1Q乙酸)、3mL0.1Q氨水溶液活化石墨化碳黑固相萃取柱，500#L提取液上樣，700#L超純水淋洗，最后用1mL75Q乙腈水溶液(含0.25Q甲酸)洗脫收集于2mL離心管中。洗脫液過0.22#m濾膜于進樣小瓶中，4°C下保存，供UPLC-MS/MS分析。

　　1.3.2超高效液相色譜條件

　　色譜柱：AcquityUPLCBEHAmide(2.1X100mm，1.7#m)流動相A:水/甲酸/氨水(500:0.075:0.3，v/v/v)，流動相B:乙腈/水/甲酸(700:300%.1，v/v/v);梯度洗脫程序：0〜2.0min，4%A;2.0〜4.0min,4〜30%A;4.2〜6.0min,30〜65QA;6.2〜8.0min,65〜4%A;柱溫40°C;樣品溫度4°C;進樣體積10#L;流速0.4mL/min。

　　1.3.3質譜條件

　　質譜條件：電噴霧離子(ESI)，多反應監測(MRM)，正負離子切換模式;離子源溫度150C;脫溶劑氣溫度600°C;脫溶劑氣流量1000L/h;錐孔氣流量150L/h。其中STX、NEO、dcSTX、dcNEO采用ESI+，毛細管電壓1.OkV，錐孔電壓10V;其他目標物采用ESI，毛細管電壓2.7kV;錐孔電壓40V;定性、定量離子對及其他參數見表1。

　　2結果與分析

　　2.1超高效液相色譜-串聯質譜法

　　PSP屬于強極性化合物，其中C1與C2、GTX1與GTX4、GTX2與GTX3、dcGTX2與dcGTX3互為同分異構體。本法前處理參考吳海燕等[7]，樣品采用1%乙酸水溶液提取、石墨化碳黑固相萃取柱凈化(旦目標物經氨基柱分離，MRM模式檢測。吳海燕采用TSK柱對PSP進行洗脫，保留時間在5.85到6.17min之間;本文利用流動相的酸堿度變化，結合梯度洗脫，可在8min內實現13種PSP的有效分離，保留時間在1.97到4.74min之間，具有可比性。

　　方法采用空白基質制作標準曲線，13種目標物在4!722ng/mL線性范圍內相關系數均大于0.996,檢出限為4!14#g/kg。方法回收率為60!105%，日內和日間相對標準偏差(RSD)分別為3!16Q和5!17%(n=3)。本方法靈敏度、回收率與精密度良好，適用于各種貝類產品中PSP的檢測(表3)。

　　2.2沿海貝類中麻痹性貝毒的監測情況

　　對沿海六省一市采集的99批次貝類產品進行分析，共檢出PSP陽性樣品17批次(圖1)，分布于浙江、江蘇、遼寧三省，其檢出率分別為46.67%、35.71%、33.33%。孫燁]統計2000~2015年PSP食品中毒事件，發現浙江省中毒案列高于其他各省，與本結果基本相符。

　　比較采樣時間(圖2)對PSP檢出率的影響，發現6月檢出率高達68.75%，7月和9月檢出率在18.75%~21.43%間。夏秋兩季是赤潮的高發季節，貝類濾食有毒藻類的幾率增加，PSP檢出率隨之增加。本次調查的貝類產品覆蓋面廣，采集時間較為分散，后期應合理增加采樣頻次，以便全面評價不同貝類中PSP的安全風險。

　　由圖3可見，6種貝類產品中共有4種貝類產品中有PSP檢出，始貝、泥蠟、毛、扇貝檢出率依次降低，分別為38.89%、23.53%、23.08%、16.67%。如表4所示，17批次陽性貝類的PSP含量在66.9〜1635.5沖3丁乂叫/1^之間，其中3批次泥蚶的PSP含量超過了聯合國衛生組織的安全限值。圖S為陽性泥蚶樣品和混合標準品中13種PSP的定量MRM色譜圖。

　　2.2陽性貝類中麻痹性貝毒的分布情況

　　PSP中STX毒性最高，其他多種毒素均通過轉換成STX當量來表示;NEO的毒力僅次于STX，這兩種毒素是PSP監測的重要指標[9]。本次監測發現在13種PSP中STX、GTX5和dcSTX的檢出率較高，分別達到72Q&1Q和71%，而NEO的檢出率為41Q，與之前文獻報道基本一致[9’10]。

　　通過毒性轉化公式將陽性樣品中的各毒素統一轉換為STXeq，并計算其在總毒素(1STXeq)中所占的百分比(圖5)。從毒素組成分析來看，陽性毛蚶中PSP主要以STX(58〜88%)形式存在，還有少量的dcGTX3、GTX5和GTX3(均<5%);其中2批次樣品還含有一定量的dcSTX(11Q和36%)。陽性泥蚶中PSP主要以dcSTX(43〜75%)、STX(12-22%)為主，此外還含有微量的01、〇2(均<7%)其中有2批次含有少量GTX2、GTX3、GTX5、dcGTX3(均<10%)。陽性扇貝中PSP以GTX5(31〜38%)、STX(34〜38%)為主要存在形式，同時含有微量dcSTX(均<6%)其中2批次樣品中GTX4的含量分別達到21%和25%。

　　在7批次的陽性貽貝中，PSP存在形式差異較大，其中1批次樣品僅含有C1一種毒素;1批次樣品含有3丁乂(50%)、〇丁乂1(29%)、4瓦〇(18%)及微量GTX2(3%)2批次樣品特征相似，主要以C2(25%和26%)、dcSTX(24和25%)和NEO(20%和25%)為主，此外還含有微量GTX2、GTX5、dcGTX3、STX(3-9%);1批次樣品主要含NEO(30%)、GTX3(20%)、dcSTX(18%)和dcGTX3(10%)，及微量C1、GTX2、GTX5、STX(2〜8%);1批次樣品以NEO(67%)和GTX3(15%)為主，同時有少量C1、GTX2、GTX5(總比<18%);1批次樣品主要以dcGTX3(28%)、C1(25%)、GTX1(23%)、GTX5(19%)形式存在，及少量dcGTX2(5%)。

　　3結論

　　采用UPLC-MS/MS方法進行了沿海貝類產品中13種PSP的定性定量分析，本方法靈敏度高、分析速度快、重現性好，可廣泛適用于各類貝類產品中麻痹性貝毒的檢測。

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