發(fā)布時(shí)間：2020-02-17所屬分類：農(nóng)業(yè)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘 要：用乙醇浸泡紫草，濃縮提取液得到紫草色素固體，然后分別制備高濃度紫草色素乙醇溶液和低濃度紫草色素乙醇溶液。建立小鼠上背部全層皮損模型(d=1cm)，并隨機(jī)進(jìn)行分組：高濃度給藥組、低濃度給藥組、模型對(duì)照組。損傷后對(duì)各組每天給予相應(yīng)試劑，觀察給
摘 要：用乙醇浸泡紫草，濃縮提取液得到紫草色素固體，然后分別制備高濃度紫草色素乙醇溶液和低濃度紫草色素乙醇溶液。建立小鼠上背部全層皮損模型(d=1cm)，并隨機(jī)進(jìn)行分組：高濃度給藥組、低濃度給藥組、模型對(duì)照組。損傷后對(duì)各組每天給予相應(yīng)試劑，觀察給藥組與對(duì)照組小鼠傷口愈合情況，創(chuàng)傷后第60天，觀察各組小鼠瘢痕形成情況，切下瘢痕皮膚作病理切片并觀察比較。結(jié)果表明小鼠皮膚全層切除后，經(jīng)過(guò)炎癥，肉芽形成，最后瘢痕化形成較正常皮膚色紅，質(zhì)硬的增生性瘢痕，HE染色見(jiàn)表皮與真皮明顯增厚，纖維組織增生明顯，汗腺，毛囊，皮脂腺結(jié)構(gòu)缺失。紫草色素給藥組小鼠傷口愈合明顯加快，瘢痕形成面積小，顏色淺，與正常皮膚邊界不明顯，HE染色見(jiàn)表皮與真皮稍增厚，纖維組織增生不明顯，汗腺、毛囊、皮脂腺結(jié)構(gòu)少數(shù)。紫草色素可明顯抑制創(chuàng)傷后的炎癥滲出，促進(jìn)小鼠皮膚傷口的愈合，并抑制增生性瘢痕的形成，其機(jī)制可能與紫草抗炎，抑制膠原合成有關(guān)。
關(guān)鍵詞：紫草色素;瘢痕;炎癥;纖維組織增生
瘢痕是各種創(chuàng)傷后所引起的皮膚組織外觀形態(tài)和組織病理學(xué)的改變的統(tǒng)稱，它是人體創(chuàng)傷(即使是輕微的損傷)后，在傷口或創(chuàng)面自然愈合過(guò)程中的一種正常的生理反應(yīng)，也是創(chuàng)傷愈合過(guò)程的必然結(jié)果。瘢痕的本質(zhì)是一種不完全具備正常皮膚組織結(jié)構(gòu)及生理功能的，有的甚至可能失去正常組織活力。中醫(yī)藥治療瘢痕具有療效好、費(fèi)用低、副作用小、兼顧性好的優(yōu)點(diǎn)，必將發(fā)揮其巨大的潛力。但現(xiàn)有治療瘢痕的方藥多為零散的單方、驗(yàn)方，尚未研制出有效的中成藥或研究確切的藥物單體，用藥途徑單一，這些都有待于進(jìn)一步研究。
紫草(Lithospermumerythrorhizon)，為紫草科(Boraginaceae)多年生草本植物，其主要品種有軟紫草(俗稱新疆紫草)、硬紫草、內(nèi)蒙紫草[1]。紫草具有涼血活血、解毒和透疹的功能，主治血熱毒盛，斑疹紫黑，麻疹不透，濕疹，水火燙傷等。紫草色素是從紫草根部提取的多種萘醌(naphthoquinone)類色素，為紫紅色萘醌類天然色素，通稱總色素，是紫草發(fā)揮治療作用的主要有效成分。紫草色素的主要成分是紫草醌及其銜生物，包括紫草素(Shikonin)、乙酰紫草素(acetylshikonin)、P,p'-二甲基丙烯酰紫草素(p,p'-dimethylacrylShikonin)、p羥基異戊酰紫草素(p-hydaro-xyisovalerylshikonin)、異戊酰紫草素(isovalerylshikonin)、去氧紫草素(deoxyshikonim)等。紫草色素主要是由母體萘茜與側(cè)鏈相連而成的化合物，主要有2種異構(gòu)形式：一種為S-型(命名為阿卡寧類，alknnin)[2]，另一種為R-型(命名為紫草素類，shikonin)，結(jié)構(gòu)如圖1所示，它們的旋光性正好相反。
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本實(shí)驗(yàn)在前期紫草研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從紫草中提取紫草色素(紫紅色萘醌類混合物)，來(lái)觀察其對(duì)抗瘢痕形成的作用，報(bào)告如下。
1材料與方法
1.1材料、試劑與儀器
1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
昆明小鼠30只(雌雄各半),健康，由同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。
1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)材料及試劑
動(dòng)物籠子、飲水瓶、標(biāo)準(zhǔn)飼料，由同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供;紫草，來(lái)源于天成大藥房;硫化鈉晶體(天津市化學(xué)試劑三廠)，苦味酸晶體(天津市恒興化學(xué)試劑有限公司)，醫(yī)用酒精(湖北省武漢市惠昌物資貿(mào)易公司分裝)，95%乙醇(上海振興化工一廠)，戊巴比妥納粉末(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，生理鹽水(武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司)，甲醛(上海溶劑廠)。
1.1.3主要儀器
基本手術(shù)器械(手術(shù)刀、止血鉗、剪刀、注射器、鑷子)，顯微觀察儀，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1紫草色素的提取
用800mL95%乙醇浸泡250g紫草[3]，24h后先用紗布過(guò)濾除去片狀藥材，再用布氏漏斗抽濾掉濾渣，將濾液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)至液體濃稠，取出備用。用回收的乙醇繼續(xù)浸泡紫草濾渣，24h后以上重復(fù)操作，合并提取液，反復(fù)5次，其間適量補(bǔ)充乙醇。最后合并的濃稠狀提取液于58℃恒溫下，烘干成紫黑色的紫草色素固塊，稱重為9.1g。紫草中的萘醌類色素成分具有對(duì)熱不穩(wěn)定性，加熱60℃以上顏色將由紅色變成紫黑色，隨溫度升高變化速度加快，薄層色譜法檢查斑點(diǎn)消失，表示紫草色素被破壞，所以此試驗(yàn)烘干過(guò)程中保持溫度在60℃以下。稱取5g制得的紫草色素固體，逐漸加入20mL無(wú)水乙醇中不斷攪拌，直到紫草色素固體無(wú)法溶解為止，過(guò)濾，稱取剩余紫草色素固體共為0.9g，制得高濃度(飽和)紫草色素乙醇溶液，濃度為0.205g/mL;用同樣方法制備飽和紫草色素乙醇溶液，稀釋至4倍體積，得試驗(yàn)所需低濃度(1/4飽和)紫草色素乙醇溶液，濃度為0.05g/mL。
1.2.2小鼠全層皮損模型的建立
配制0.01g/L的戊巴比妥溶液，按照10mL/kg劑量對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，約10min后小鼠進(jìn)入完全麻醉狀態(tài)。將小鼠固定在手術(shù)臺(tái)上，用新鮮配制的8%硫化鈉溶液作為去毛劑，將小鼠上背部去毛，并用記號(hào)筆描繪出d=1cm的圓形標(biāo)記，用酒精擦拭消毒，然后用手術(shù)剪刀切除小鼠上背部標(biāo)記的皮膚，建立小鼠上背部皮膚全切傷口模型(圖2)。造模后，小鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、高濃度給藥組(紫草色素0.205g/mL)、低濃度給藥組(紫草色素0.05g/mL)3組。每組10只，雌雄各半。將每只小鼠放于一個(gè)小鼠籠飼養(yǎng)，每天傷口涂藥1次。給予標(biāo)準(zhǔn)飼料、自來(lái)水，自然光照，并定期換墊料、清潔，室溫保持在18～23℃飼養(yǎng)。
1.2.3瘢痕組織制備病理切片
傷后60天處死小鼠，切取瘢痕皮膚，經(jīng)生理鹽水清洗，用4%甲醛固定，石蠟包埋，HE染色觀察。
2結(jié)果與分析
2.1各組小鼠一般情況及體重
模型組與對(duì)照組小鼠的活動(dòng)情況并無(wú)差異，手術(shù)麻醉效果結(jié)束后均呈現(xiàn)虛弱狀態(tài)，于6～18h后恢復(fù)正常生活狀態(tài)，皆與健康小鼠無(wú)異。
2.2傷口愈合期間各組小鼠創(chuàng)傷情況各項(xiàng)指標(biāo)
2.2.1傷后5天
三組小鼠上背部傷口均呈現(xiàn)愈合狀態(tài)，共同表現(xiàn)為術(shù)后1～5天均有不同程度炎性滲出液，皮膚自傷口外緣向內(nèi)逐漸產(chǎn)生收縮趨勢(shì)，肉芽組織產(chǎn)生并由外向內(nèi)逐漸擴(kuò)散，逐漸在皮膚損傷處由外向內(nèi)結(jié)起一層圓形的痂，整體痂大小為皮膚損傷原大小d=1cm左右，與手術(shù)時(shí)傷口大小差異較小。
其不同處在于：模型對(duì)照組炎性滲出液較多，第5天依然有半數(shù)小鼠傷口處的中心部分呈現(xiàn)炎性滲出液浸潤(rùn)狀態(tài)，即痂未完全長(zhǎng)成，肉芽組織由外向內(nèi)生長(zhǎng)速度較慢，炎性反應(yīng)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，且損傷處結(jié)痂較薄(圖3);高濃度組炎性滲出液較少，3天后不再產(chǎn)生，第5天為止全組小鼠皮膚損傷處結(jié)起一層完整的圓形的痂且痂表面干燥，并持續(xù)逐漸增厚(圖3);低濃度組炎性滲出液較少，3天后不再產(chǎn)生，第5天為止全組小鼠皮膚損傷處結(jié)起一層完整的圓形的痂且痂表面干燥，并持續(xù)逐漸增厚。在此期間與高濃度組差別不大(圖3)。注：模型組結(jié)痂為桔紅色為自然皮膚損傷結(jié)痂的眼色，而給藥組呈現(xiàn)紫紅色，為紫草色素乙醇溶液固有顏色，高濃度組色深，低濃度組色淺。
2.2.2傷后10天
三組小鼠上背部傷口處繼續(xù)呈現(xiàn)愈合狀態(tài)，肉芽組織迅生長(zhǎng)填充創(chuàng)傷處，結(jié)起一層痂，損傷處皮膚邊緣持續(xù)呈現(xiàn)由外向內(nèi)收縮狀態(tài)。其不同處在于：模型對(duì)照組炎性滲出液較1～5天內(nèi)明顯變少，但傷口處痂表面依然不呈現(xiàn)干燥狀態(tài)，撫之質(zhì)硬，但略有粘滯感;痂薄，增厚速度慢，10天后痂成型，痂面積較手術(shù)時(shí)傷口面積小，d=0.8±0.1cm(圖4);高濃度組無(wú)炎性滲出液，痂已呈現(xiàn)完全干燥狀態(tài)，撫之質(zhì)硬且厚，整個(gè)痂面積與手術(shù)時(shí)創(chuàng)傷面積差異不明顯d=0.9±0.1cm(圖4);低濃度組無(wú)炎性滲出液，痂呈現(xiàn)完全干燥狀態(tài)，撫之質(zhì)硬且厚，但比高濃度組略薄，整個(gè)痂面積與手術(shù)時(shí)創(chuàng)傷面積差異不明顯d=0.9±0.1cm(圖4)。
2.2.3 傷后20天
三組小鼠上背部傷口處繼續(xù)穩(wěn)定愈合。模型對(duì)照組：痂較10天前逐漸變硬，但厚度無(wú)明顯差異，撫之干燥。20天后，d為(0.6±0.1)cm(圖5)。給藥組：痂在15～20天內(nèi)逐漸脫落，高低濃度給藥兩組在痂脫時(shí)間上無(wú)明顯差別。痂脫前面積大小并無(wú)差異，只是痂周圍皮膚較之前干凈整潔(圖5)。痂脫落后，原創(chuàng)傷處中心只剩有一個(gè)明顯小于之前痂面積的傷口(圖5)，也明顯小于同期的對(duì)照組傷口。傷口呈規(guī)則圓形，微有滲出液浸潤(rùn)，這和痂脫落與小鼠主動(dòng)撕扯有關(guān)。繼續(xù)給藥后2天，炎性滲出液消失，新結(jié)起一層薄痂覆蓋在創(chuàng)傷處，除了顏色為紫紅色以外面積較小以外，形態(tài)與模型對(duì)照組無(wú)異。20天后，高濃度組d為(0.3±0.1)cm，低濃度組d為(0.4±0.1)cm。
2.2.4傷后35天
三組小鼠上背部傷口繼續(xù)穩(wěn)定愈合，痂逐漸層狀脫落，21～25天內(nèi)小鼠新毛逐漸長(zhǎng)出，對(duì)照組(圖6)與給藥組(圖6)長(zhǎng)毛時(shí)間與形態(tài)并無(wú)明顯差異，對(duì)照組傷口d=(0.2±0.1)，給藥組傷口d=(0.2±0.1)。30天后，3組小鼠痂已完全脫落，有嫩紅顏色的瘢痕組織出現(xiàn)，瘢痕面積與結(jié)痂大小無(wú)明顯差別。35天后，撥開(kāi)三組小鼠上背部原創(chuàng)傷處新生的毛已可看到比正常皮膚顏色紅的瘢痕，對(duì)照組(圖7)所見(jiàn)瘢痕比給藥組(圖7)明顯，但此時(shí)不易脫毛觀察，因?yàn)榱蚧c去毛劑有一定刺激性，會(huì)損傷原創(chuàng)傷處新生皮膚造成新的傷口。所以暫不做脫毛觀察。
2.2.5傷后60天
用8%硫化鈉做去毛劑，給3組小鼠手術(shù)部位去毛，觀察瘢痕形成情況。繪制圖表。
模型組、高濃度組、低濃度組(圖8)
2.3各組小鼠瘢痕組織制片染色病理學(xué)結(jié)果
組織切片用HE染色，其中正常皮膚真皮組織血管數(shù)較少，毛囊數(shù)多，脂肪細(xì)胞多，纖維組織少，真皮厚度約為230μm，表皮厚度約為15μm(圖9，13);模型組小鼠血管很少，毛囊少，脂肪多，纖維組織很多且稠密，真皮厚度約為280μm，表皮厚度約為38μm(圖10，14);高濃度組小鼠血管少見(jiàn)，毛囊較多，脂肪細(xì)胞較少,纖維組織層比模型組明顯變薄，真皮厚度約為200μm，表皮厚度約為25μm(圖11，15);低濃度組小鼠血管少見(jiàn)，毛囊較多，脂肪細(xì)胞較多,纖維組織層比模型組明顯變薄，真皮厚度約為200μm，表皮厚度約為7.5μm(圖12，16)
3結(jié)論
通過(guò)60天后對(duì)各小組小鼠瘢痕形成情況的對(duì)比易可見(jiàn)：用藥組小鼠的皮膚恢復(fù)情況明顯較對(duì)照組更接近于小鼠正常皮膚，形成的瘢痕面積較小，顏色粉嫩，與正常皮膚界限不明顯，瘢痕形成較為光滑。通過(guò)瘢痕組織制片顯微觀察可得：用藥組的瘢痕纖維組織層比對(duì)照組明顯變薄，真皮厚度接近正常皮膚，而對(duì)照組生成了較厚的瘢痕組織。抗炎作用是紫草的傳統(tǒng)藥效，即消炎，收斂和解熱。自古以來(lái)，人們就利用紫草根處理傷口，直到1976年，紫草的這一藥用性才得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)。臨床研究表明，用紫草制成的藥劑具有很好的愈合傷口和抗炎的作用，紫草的乙醇、水、乙醚提取物均有一定的抗炎作用。紫草抗炎的主要有效成分是紫草素(Shikonin)和乙酰紫草素(acetylshikonin)，它們對(duì)炎癥急性滲出期的血管通透性亢進(jìn)，滲出和水腫有明顯的拮抗作用[4]。
乙酰紫草素(acetylshikonin)、β、β-二甲基丙烯酰紫草素(β、β-dinethylacrylshikonin)均能顯著抑制組織胺引起的局部血管通透性亢進(jìn)(前者5mg/kg，腹腔注射，抑制率34.5%;后者10mg/kg，腹腔注射，抑制率38%)。
20世紀(jì)90年代的一項(xiàng)研究表明，紫草素具有抑制白三烯B4(leukotrieneB4)和5-羥基二十碳四烯酸(5-hydroxyeicosateranoicacid)生物合成的作用[5]。LTB4和5-HETE是AA的代謝產(chǎn)物，前者是白細(xì)胞的強(qiáng)趨化劑，后者為白細(xì)胞的激活劑，在炎癥過(guò)程中起重要作用。
瘢痕的主要成分是膠原纖維。正常情況下，傷口內(nèi)的膠原合成與分解呈動(dòng)態(tài)平衡，多種因素可破壞這種平衡，導(dǎo)致成纖維、肌纖維母細(xì)胞合成膠原增多，阻礙膠原增多，阻礙膠原酶活性，造成瘢痕過(guò)度增生，體內(nèi)合成膠原增速;膠原酶的活性也升高，表示膠原的分解較正常皮膚增加;但因膠原合成速度遠(yuǎn)大于膠原分解，最終導(dǎo)致了膠原沉積。
以下從幾種角度說(shuō)明此次試驗(yàn)中可能影響小鼠傷口處膠原代謝失衡的原因：
(1)小鼠傷口創(chuàng)面感染和血腫。傷口創(chuàng)面感染后易發(fā)生瘢痕，因?yàn)閯?chuàng)面感染后發(fā)生炎性反應(yīng)，創(chuàng)面炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)菌毒素能抑制上皮細(xì)胞的移行和增殖，組織蛋白和真皮的多糖被消耗，肌成纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞迅速增多。肉芽組織增生過(guò)度，易于形成瘢痕組織。一般情況下，感染越久，則形成瘢痕的程度越嚴(yán)重。感染的傷口如不充分將炎性滲出液引流或清除壞死組織，傷口將難以愈合，即使能愈合，愈后也會(huì)較容易形成瘢痕。同時(shí)，創(chuàng)面血腫為感染創(chuàng)造了條件，對(duì)傷口愈合也產(chǎn)生不良影響，將有利于瘢痕的形成。由上述紫草抗炎作用可得知，紫草色素給藥組小鼠的創(chuàng)傷部位發(fā)生炎性反應(yīng)的時(shí)間比模型對(duì)照組的時(shí)間短，并且炎性反應(yīng)較輕，所以模型對(duì)照組小鼠傷口處形成的瘢痕較給藥組明顯。同時(shí)，紫草色素另有止血的作用，對(duì)于小鼠傷口處的停止出血時(shí)間起到一定的幫助。
(2)小鼠傷口創(chuàng)面異物。若小鼠上背部傷口創(chuàng)面落有灰塵、木屑、毛發(fā)、棉花纖維等異物，可刺激瘢痕組織增生，較容易誘發(fā)更多的瘢痕形成。由本次試驗(yàn)中的傷口愈合過(guò)程可知，紫草色素給藥組的小鼠創(chuàng)面上結(jié)痂的速度較模型對(duì)照組快，且痂不斷增厚，在結(jié)痂的時(shí)間內(nèi)對(duì)痂下的皮膚創(chuàng)面愈合起到了隔絕外界的保護(hù)作用，所以痂下皮膚愈合速度變快，愈合后傷口形狀更規(guī)則。
(3)慢性刺激。小鼠傷口創(chuàng)面處的瘢痕與摩擦，搔抓等慢性刺激有關(guān)，這些刺激都有利于瘢痕的形成，同時(shí)，小鼠的活動(dòng)也會(huì)帶動(dòng)創(chuàng)面邊緣皮膚的拉扯，使傷口創(chuàng)面處在不穩(wěn)定的環(huán)境中，延長(zhǎng)了傷口的愈合時(shí)間。所以可得，紫草色素給藥組的小鼠創(chuàng)面上結(jié)成的痂較厚，對(duì)創(chuàng)面皮膚起到了一定的固定作用。
(4)小鼠創(chuàng)面修復(fù)的時(shí)間。創(chuàng)面愈合時(shí)間越早，瘢痕的發(fā)生率越低，否則瘢痕的發(fā)生率就增高。
如上所述，紫草色素有加速傷口愈合的藥理作用，并一定程度減輕了瘢痕的發(fā)生率。
