發(fā)布時(shí)間：2020-02-15所屬分類：科技論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要:目的:研究纖維素酶提取地桃花多糖的最佳條件，并探討其體外抗氧化活性。方法:以地桃花多糖得率為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以液料比、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶添加量為試驗(yàn)因素，采用響應(yīng)面法建立數(shù)學(xué)模型，篩選最佳提取工藝條件;并使用DPPH和OH自由
摘要:目的:研究纖維素酶提取地桃花多糖的最佳條件，并探討其體外抗氧化活性。方法:以地桃花多糖得率為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以液料比、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶添加量為試驗(yàn)因素，采用響應(yīng)面法建立數(shù)學(xué)模型，篩選最佳提取工藝條件;并使用DPPH和·OH自由基清除能力體系檢測(cè)地桃花多糖的抗氧化活性。結(jié)果:纖維素酶酶解提取地桃花多糖最佳條件為:酶添加量10.8mg/mL、酶解時(shí)間72min、液料比7∶1mL/g、酶解溫度43℃、pH為5.0，在此條件下地桃花多糖得率為13.32%，與理論值13.37%相對(duì)誤差小于5%。地桃花多糖具有較強(qiáng)的抗氧活性，對(duì)DPPH和·OH自由基清除的半數(shù)抑制濃度IC50分別為1.082、3.202mg/mL，但與維生素C比較，抗氧化活性較弱。結(jié)論:通過響應(yīng)面法獲得地桃花多糖纖維素酶酶法提取的最佳條件，該工藝條件方便可行，提取到的多糖具有較強(qiáng)的自由基清除能力。
關(guān)鍵詞:地桃花，多糖，酶法，提取，響應(yīng)面法，抗氧化活性
天然植物多糖具有抗炎、抗氧化[1]、增強(qiáng)免疫[2]、抗病毒[3]、防衰老[4]等多種藥理作用，且毒副作用低，越來越受到學(xué)者的重視[5]。植物多糖可作為食品和藥品的有效添加成分，藥食兩用植物多糖系列產(chǎn)品的市場(chǎng)前景將非常廣闊[6]。天然產(chǎn)物多糖來自于植物細(xì)胞膜和微生物細(xì)胞壁的天然高分子化合物，可采用有機(jī)溶劑、酶解等方法提取，其中酶解提取操作簡(jiǎn)單、條件較溫和，在多糖結(jié)構(gòu)研究以及活性保持方面具有一定的優(yōu)勢(shì)[7]。
相關(guān)期刊推薦：《食品工業(yè)科技》雜志創(chuàng)刊于1979年，國家輕工業(yè)聯(lián)合會(huì)(原國家輕工業(yè)部)主管，北京市食品工業(yè)研究所主辦。技術(shù)探討包括：研究與探討，工藝技術(shù)，包裝與機(jī)械，食品添加劑，食品安全，儲(chǔ)運(yùn)保鮮，分析檢測(cè)，綜述等，以新技術(shù)及實(shí)用技術(shù)為核心，啟發(fā)企業(yè)技術(shù)人員思路，開發(fā)新產(chǎn)品。讀者群：面向全國大中型食品企業(yè)，政府管理機(jī)構(gòu)，食品及相關(guān)專業(yè)大專院校，綜合性科技期刊覆蓋食品各分支行業(yè)，不論對(duì)企業(yè)決策者，還是研發(fā)人員都能提供有益的幫助。
地桃花(UrenalobataL.)又稱肖梵天花、假桃花、野棉花等，屬于錦葵科植物，主要產(chǎn)于廣西、四川及貴州等地，富含多種藥效成分如多糖類、黃酮類、苷類、香豆素、木脂素以及蛋白質(zhì)[8-10]。研究報(bào)道地桃花提取物具有明顯的抗炎、抗菌及抗氧化等藥理活性[11-13]。地桃花可清熱解毒、祛風(fēng)利濕及活血消腫，用于治療感冒、痢疾等疾病，是中成藥花紅片生產(chǎn)的原料成分之一[14]，對(duì)其有效成分多糖的研發(fā)將有助于提升其藥食兩用價(jià)值。目前有關(guān)地桃花單一成分提取及其生物活性的研究報(bào)道很少，針對(duì)多糖成分，僅見藍(lán)峻峰等采用超聲波輔助半仿生法提取，結(jié)果表明，在液料比30∶1、超聲功率60W、提取溫度75℃、提取時(shí)間50min的條件下，地桃花多糖得率為12.86%[14]，此工藝相比酶法具有提取溫度高、需要超聲設(shè)備、工藝復(fù)雜等缺點(diǎn)。為了解地桃花多糖生物活性及優(yōu)化其提取工藝，本文研究了纖維素酶提取地桃花多糖的最佳條件，并探討其體外抗氧化活性，為地桃花多糖進(jìn)一步開發(fā)及抗氧化活性的深入研究提供一定的科技支持。
1材料與方法
1.1材料與儀器
地桃花采自廣西容縣，經(jīng)陳曉白教授鑒定為錦葵科梵天花屬地桃花干燥全草;纖維素酶(食品級(jí)，5萬U/g)、維生素C、D-無水葡萄糖購自北京索萊寶科技有限公司;DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)購自日本TCI公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。
5810R型高速離心機(jī)德國Eppendorf;Alpha-1506型紫外分光光度計(jì)上海譜元儀器;SHA-BA雙功能水浴恒溫振蕩器常州華普達(dá)教學(xué)儀器;PHS-25型pH計(jì)上海雷磁;SHB-III型循環(huán)水真空泵、2L-ARE旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海皓莊儀器。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1地桃花多糖的提取地桃花全草自然晾干，精確稱取5.0g粉碎并過100目篩后的地桃花粉，按設(shè)定酶解條件(pH、液料比、酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度)，在180r/min搖床上進(jìn)行酶解提取實(shí)驗(yàn)，得到多糖浸提液。多糖浸提液經(jīng)90℃高溫滅活、6000r/min離心分離10min、抽濾、濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀80℃濃縮至1/10、乙醇沉淀、Sevag法除蛋白、透析除雜、乙醇二次沉淀、真空冷凍干燥(溫度-55℃，壓力0.05MPa)一系列步驟[15]，最終獲得地桃花多糖。
1.2.2地桃花多糖含量的測(cè)定多糖測(cè)定采用苯酚-硫酸法[16]，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=8.4986x-0.0185，R2=0.9903，式中y為490nm條件下的吸光度值，x為葡萄糖質(zhì)量濃度(mg/mL)。多糖得率計(jì)算公式如下:
1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)酶解時(shí)搖床轉(zhuǎn)速固定為180r/min，分別考察pH(3.0、4.0、5.0、6.0)、液料比(4∶1、8∶1、12∶1、16∶1、20∶1、24∶1mL/g)、酶添加量(2、6、10、14、18mg/mL)、酶解時(shí)間(40、80、120、160、200min)和酶解溫度(35、45、55、65℃)對(duì)地桃花多糖得率的影響，其中各因素固定水平為pH5.0、液料比8∶1mL/g、酶添加量10mg/mL、酶解時(shí)間80min、酶解溫度45℃。
1.2.4響應(yīng)面試驗(yàn)響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)見表1，自變量包括液料比、酶解時(shí)間、酶添加量、酶解溫度四個(gè)因素，以多糖得率為響應(yīng)值。響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平表如表1所示。
1.2.5地桃花多糖體外抗氧化活性測(cè)定
1.2.5.1DPPH自由基清除能力測(cè)定取不同質(zhì)量濃度的地桃花多糖溶液2mL和2mLDPPH溶液(0.2mmol/L)混勻，反應(yīng)30min后在517nm處測(cè)定其吸光度A1，同法測(cè)定2.0mL乙醇加樣液的吸光度A2，以及2.0mLDPPH溶液與2.0mL蒸餾水的吸光度A0，以維生素C作為對(duì)照，樣品對(duì)DPPH自由基的清除率Y(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100[15]。
1.2.5.2·OH的清除能力測(cè)定取不同質(zhì)量濃度的地桃花多糖溶液2mL，依次加入濃度均為5mmol/L的FeSO4溶液、H2O2溶液各2mL，混勻，靜置10min，再加入5mmol/L的水楊酸溶液2mL，混勻，37℃水浴30min后，波長(zhǎng)510nm處測(cè)定吸光度B1，用蒸餾水代替水楊酸測(cè)定吸光度B2，以蒸餾水代替樣品溶液測(cè)定吸光度B0，以維生素C作為對(duì)照，樣品對(duì)·OH的清除率Y(%)=[1-(B1-B2)/B0]×100[15-16]。
1.3數(shù)據(jù)處理
所用數(shù)據(jù)是3次平行實(shí)驗(yàn)的均值±標(biāo)準(zhǔn)差，響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析采用DesignExpert8.06軟件，采用SPSS20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)間的顯著性分析，并利用GraphPadPrism6.0軟件進(jìn)行繪圖。
2結(jié)果與分析
2.1單因素實(shí)驗(yàn)
2.1.1纖維素酶添加量對(duì)地桃花多糖得率的影響由圖1可知，當(dāng)酶添加量從2mg/mL增加到10mg/mL時(shí)，多糖得率顯著提高(p<0.05)，由8.19%上升至12.78%，進(jìn)一步加大酶用量，多糖得率沒有顯著變化(p>0.05)，說明在該底物濃度下，酶濃度已經(jīng)趨于飽和，繼續(xù)增加纖維素酶用量，對(duì)多糖得率沒有顯著影響(p>0.05)。因此，選擇10mg/mL作為纖維素酶的最佳添加量。
2.1.2pH對(duì)地桃花多糖得率的影響由圖2可知，當(dāng)pH由3.0增加到5.0時(shí)，多糖得率由8.65%增加至最大值12.46%(p<0.05)，pH增大到6.0時(shí)，多糖得率反而減小，得率為11.98%，與pH4.0、pH5.0比較差異均不顯著(p>0.05)。因?yàn)樵谧钸mpH時(shí)，酶分子上活性基團(tuán)的解離狀態(tài)最適于與底物結(jié)合，pH高于或低于最適pH時(shí)，活性基團(tuán)的解離狀態(tài)可能發(fā)生改變，酶和底物結(jié)合力減弱，酶反應(yīng)速率降低。因此，酶解最適pH選定為5.0。
2.1.3液料比對(duì)地桃花多糖得率的影響由圖3可知，當(dāng)液料比由4∶1增加到8∶1時(shí)，多糖得率由9.45%增加至13.25%(p<0.05)，之后，隨著液料比繼續(xù)增大，多糖得率反而減小，原因可能與過高液料比不利于多糖物質(zhì)溶出有關(guān)，此外，水用量過大加重后續(xù)濃縮工作負(fù)擔(dān)，不利于工業(yè)化實(shí)際生產(chǎn)。故液料比選擇為8∶1mL/g。
2.1.4酶解溫度對(duì)地桃花多糖得率的影響由圖4可知，溫度由35℃上升到45℃，多糖得率由9.35%增大至13.28%，主要因?yàn)闇囟壬咴鰪?qiáng)酶活性，促進(jìn)有效成分溶出，55℃時(shí)多糖得率為13.07%，與45℃比較變化不顯著(p>0.05)，進(jìn)一步提高溫度至65℃，此時(shí)多糖得率顯著減小(p<0.05)，這是因?yàn)闇囟冗^高導(dǎo)致酶活力減弱所致。因此選擇45℃為最適酶解溫度。
2.1.5酶解時(shí)間對(duì)地桃花多糖得率的影響由圖5可知，酶解40min時(shí)多糖得率為8.65%，當(dāng)時(shí)間延長(zhǎng)至80min時(shí)，多糖得率接近160min時(shí)的最大值，再繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，多糖得率變化不顯著(p>0.05)，多糖提取效率反而降低，此外，酶解時(shí)間過長(zhǎng)，酶催化活性減弱反而對(duì)多糖提取不利，考慮實(shí)際生產(chǎn)效率。因此，本研究選擇80min為最佳酶解時(shí)間。
2.3地桃花多糖的體外抗氧化活性
2.3.1地桃花多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用由圖7可知，當(dāng)?shù)靥一ǘ嗵菨舛仍?.2～10mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基清除率不斷增大，當(dāng)質(zhì)量濃度為10mg/mL時(shí)，地桃花多糖對(duì)DPPH自由基清除率為90.06%，而維生素C對(duì)DPPH自由基清除率可達(dá)94.12%，地桃花多糖清除DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度IC50為1.082mg/mL，維生素C的IC50為0.643mg/mL，兩者比較，地桃花多糖清除能力較弱于維生素C。以上結(jié)果提示地桃花多糖具有較好的DPPH自由基清除作用。
2.3.2地桃花多糖對(duì)·OH清除作用由圖8可知，當(dāng)?shù)靥一ǘ嗵菨舛仍?.2～10mg/mL時(shí)，對(duì)·OH清除率穩(wěn)步提升，而維生素C在濃度4mg/mL時(shí)對(duì)·OH清除率就已達(dá)到最大值，之后趨于穩(wěn)定。當(dāng)質(zhì)量濃度為10mg/mL時(shí)，地桃花多糖對(duì)·OH清除率為89.75%，維生素C對(duì)·OH清除率可達(dá)96.38%，地桃花多糖清除·OH的IC50為3.202mg/mL，維生素C的IC50為0.368mg/mL，兩者比較，維生素C清除能力強(qiáng)于地桃花多糖。以上結(jié)果說明，地桃花多糖具有較好的·OH清除作用。
3討論與結(jié)論
本研究在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)考察了地桃花多糖纖維素酶提取的工藝。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，纖維素酶添加量對(duì)地桃花多糖得率影響最大，其次是酶解時(shí)間和液料比，而酶解溫度對(duì)其多糖提取影響最小;地桃花多糖最佳酶解提取條件為酶添加量10.8mg/mL、酶解時(shí)間72min、液料比7∶1mL/g、酶解溫度43℃、pH=5.0，在此條件下地桃花多糖的得率為13.32%，與回歸模型方程預(yù)測(cè)值13.37%相比，相對(duì)誤差小于5%。藍(lán)峻峰等[14]探討超聲波法輔助半仿生法提取地桃花中多糖的最佳工藝，采用半仿生提取，在超聲波協(xié)同作用的基礎(chǔ)上，以正交試驗(yàn)法考察超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度等因素對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果獲得地桃花多糖得率為12.86%，稍小于本研究中的多糖得率，本研究酶法提取溫度43℃明顯低于其提取溫度75℃，節(jié)約能源，且不需要大型設(shè)備，液料比明顯減小，可一定程度上提高生產(chǎn)效率。
體外抗氧化活性試驗(yàn)表明，地桃花多糖對(duì)DPPH自由基、·OH均具有較強(qiáng)的清除能力，在本實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度下，其對(duì)兩種自由基的清除能力均呈現(xiàn)一定的正相關(guān)關(guān)系。地桃花多糖清除DPPH自由基的IC50為1.082mg/mL，清除·OH的IC50為3.202mg/mL。但與維生素C比較，地桃花多糖清除兩種自由基的能力較弱。薛井中等也研究地桃花水提取物清除·OH和DPPH自由基、及抑制油脂氧化的能力，結(jié)果表明地桃花提取物各部位均有一定的抗氧化能力，但抗氧化活性都弱于維生素C[17]，與本研究結(jié)果一致。以上結(jié)果為地桃花功能成分的研究開發(fā)提供一定的前期理論基礎(chǔ)。
