發布時間：2020-02-15所屬分類：科技論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要:目的:研究纖維素酶提取地桃花多糖的最佳條件，并探討其體外抗氧化活性。方法:以地桃花多糖得率為響應值，在單因素試驗基礎上，以液料比、酶解溫度、酶解時間、酶添加量為試驗因素，采用響應面法建立數學模型，篩選最佳提取工藝條件;并使用DPPH和OH自由
摘要:目的:研究纖維素酶提取地桃花多糖的最佳條件，并探討其體外抗氧化活性。方法:以地桃花多糖得率為響應值，在單因素試驗基礎上，以液料比、酶解溫度、酶解時間、酶添加量為試驗因素，采用響應面法建立數學模型，篩選最佳提取工藝條件;并使用DPPH和·OH自由基清除能力體系檢測地桃花多糖的抗氧化活性。結果:纖維素酶酶解提取地桃花多糖最佳條件為:酶添加量10.8mg/mL、酶解時間72min、液料比7∶1mL/g、酶解溫度43℃、pH為5.0，在此條件下地桃花多糖得率為13.32%，與理論值13.37%相對誤差小于5%。地桃花多糖具有較強的抗氧活性，對DPPH和·OH自由基清除的半數抑制濃度IC50分別為1.082、3.202mg/mL，但與維生素C比較，抗氧化活性較弱。結論:通過響應面法獲得地桃花多糖纖維素酶酶法提取的最佳條件，該工藝條件方便可行，提取到的多糖具有較強的自由基清除能力。
關鍵詞:地桃花，多糖，酶法，提取，響應面法，抗氧化活性
天然植物多糖具有抗炎、抗氧化[1]、增強免疫[2]、抗病毒[3]、防衰老[4]等多種藥理作用，且毒副作用低，越來越受到學者的重視[5]。植物多糖可作為食品和藥品的有效添加成分，藥食兩用植物多糖系列產品的市場前景將非常廣闊[6]。天然產物多糖來自于植物細胞膜和微生物細胞壁的天然高分子化合物，可采用有機溶劑、酶解等方法提取，其中酶解提取操作簡單、條件較溫和，在多糖結構研究以及活性保持方面具有一定的優勢[7]。
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地桃花(UrenalobataL.)又稱肖梵天花、假桃花、野棉花等，屬于錦葵科植物，主要產于廣西、四川及貴州等地，富含多種藥效成分如多糖類、黃酮類、苷類、香豆素、木脂素以及蛋白質[8-10]。研究報道地桃花提取物具有明顯的抗炎、抗菌及抗氧化等藥理活性[11-13]。地桃花可清熱解毒、祛風利濕及活血消腫，用于治療感冒、痢疾等疾病，是中成藥花紅片生產的原料成分之一[14]，對其有效成分多糖的研發將有助于提升其藥食兩用價值。目前有關地桃花單一成分提取及其生物活性的研究報道很少，針對多糖成分，僅見藍峻峰等采用超聲波輔助半仿生法提取，結果表明，在液料比30∶1、超聲功率60W、提取溫度75℃、提取時間50min的條件下，地桃花多糖得率為12.86%[14]，此工藝相比酶法具有提取溫度高、需要超聲設備、工藝復雜等缺點。為了解地桃花多糖生物活性及優化其提取工藝，本文研究了纖維素酶提取地桃花多糖的最佳條件，并探討其體外抗氧化活性，為地桃花多糖進一步開發及抗氧化活性的深入研究提供一定的科技支持。
1材料與方法
1.1材料與儀器
地桃花采自廣西容縣，經陳曉白教授鑒定為錦葵科梵天花屬地桃花干燥全草;纖維素酶(食品級，5萬U/g)、維生素C、D-無水葡萄糖購自北京索萊寶科技有限公司;DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)購自日本TCI公司;其它試劑均為國產分析純。
5810R型高速離心機德國Eppendorf;Alpha-1506型紫外分光光度計上海譜元儀器;SHA-BA雙功能水浴恒溫振蕩器常州華普達教學儀器;PHS-25型pH計上海雷磁;SHB-III型循環水真空泵、2L-ARE旋轉蒸發器上海皓莊儀器。
1.2實驗方法
1.2.1地桃花多糖的提取地桃花全草自然晾干，精確稱取5.0g粉碎并過100目篩后的地桃花粉，按設定酶解條件(pH、液料比、酶添加量、酶解時間、酶解溫度)，在180r/min搖床上進行酶解提取實驗，得到多糖浸提液。多糖浸提液經90℃高溫滅活、6000r/min離心分離10min、抽濾、濾液用旋轉蒸發儀80℃濃縮至1/10、乙醇沉淀、Sevag法除蛋白、透析除雜、乙醇二次沉淀、真空冷凍干燥(溫度-55℃，壓力0.05MPa)一系列步驟[15]，最終獲得地桃花多糖。
1.2.2地桃花多糖含量的測定多糖測定采用苯酚-硫酸法[16]，葡萄糖標準曲線方程為y=8.4986x-0.0185，R2=0.9903，式中y為490nm條件下的吸光度值，x為葡萄糖質量濃度(mg/mL)。多糖得率計算公式如下:
1.2.3單因素實驗酶解時搖床轉速固定為180r/min，分別考察pH(3.0、4.0、5.0、6.0)、液料比(4∶1、8∶1、12∶1、16∶1、20∶1、24∶1mL/g)、酶添加量(2、6、10、14、18mg/mL)、酶解時間(40、80、120、160、200min)和酶解溫度(35、45、55、65℃)對地桃花多糖得率的影響，其中各因素固定水平為pH5.0、液料比8∶1mL/g、酶添加量10mg/mL、酶解時間80min、酶解溫度45℃。
1.2.4響應面試驗響應面因素水平設計見表1，自變量包括液料比、酶解時間、酶添加量、酶解溫度四個因素，以多糖得率為響應值。響應面試驗因素及水平表如表1所示。
1.2.5地桃花多糖體外抗氧化活性測定
1.2.5.1DPPH自由基清除能力測定取不同質量濃度的地桃花多糖溶液2mL和2mLDPPH溶液(0.2mmol/L)混勻，反應30min后在517nm處測定其吸光度A1，同法測定2.0mL乙醇加樣液的吸光度A2，以及2.0mLDPPH溶液與2.0mL蒸餾水的吸光度A0，以維生素C作為對照，樣品對DPPH自由基的清除率Y(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100[15]。
1.2.5.2·OH的清除能力測定取不同質量濃度的地桃花多糖溶液2mL，依次加入濃度均為5mmol/L的FeSO4溶液、H2O2溶液各2mL，混勻，靜置10min，再加入5mmol/L的水楊酸溶液2mL，混勻，37℃水浴30min后，波長510nm處測定吸光度B1，用蒸餾水代替水楊酸測定吸光度B2，以蒸餾水代替樣品溶液測定吸光度B0，以維生素C作為對照，樣品對·OH的清除率Y(%)=[1-(B1-B2)/B0]×100[15-16]。
1.3數據處理
所用數據是3次平行實驗的均值±標準差，響應面數據分析采用DesignExpert8.06軟件，采用SPSS20.0進行數據間的顯著性分析，并利用GraphPadPrism6.0軟件進行繪圖。
2結果與分析
2.1單因素實驗
2.1.1纖維素酶添加量對地桃花多糖得率的影響由圖1可知，當酶添加量從2mg/mL增加到10mg/mL時，多糖得率顯著提高(p<0.05)，由8.19%上升至12.78%，進一步加大酶用量，多糖得率沒有顯著變化(p>0.05)，說明在該底物濃度下，酶濃度已經趨于飽和，繼續增加纖維素酶用量，對多糖得率沒有顯著影響(p>0.05)。因此，選擇10mg/mL作為纖維素酶的最佳添加量。
2.1.2pH對地桃花多糖得率的影響由圖2可知，當pH由3.0增加到5.0時，多糖得率由8.65%增加至最大值12.46%(p<0.05)，pH增大到6.0時，多糖得率反而減小，得率為11.98%，與pH4.0、pH5.0比較差異均不顯著(p>0.05)。因為在最適pH時，酶分子上活性基團的解離狀態最適于與底物結合，pH高于或低于最適pH時，活性基團的解離狀態可能發生改變，酶和底物結合力減弱，酶反應速率降低。因此，酶解最適pH選定為5.0。
2.1.3液料比對地桃花多糖得率的影響由圖3可知，當液料比由4∶1增加到8∶1時，多糖得率由9.45%增加至13.25%(p<0.05)，之后，隨著液料比繼續增大，多糖得率反而減小，原因可能與過高液料比不利于多糖物質溶出有關，此外，水用量過大加重后續濃縮工作負擔，不利于工業化實際生產。故液料比選擇為8∶1mL/g。
2.1.4酶解溫度對地桃花多糖得率的影響由圖4可知，溫度由35℃上升到45℃，多糖得率由9.35%增大至13.28%，主要因為溫度升高增強酶活性，促進有效成分溶出，55℃時多糖得率為13.07%，與45℃比較變化不顯著(p>0.05)，進一步提高溫度至65℃，此時多糖得率顯著減小(p<0.05)，這是因為溫度過高導致酶活力減弱所致。因此選擇45℃為最適酶解溫度。
2.1.5酶解時間對地桃花多糖得率的影響由圖5可知，酶解40min時多糖得率為8.65%，當時間延長至80min時，多糖得率接近160min時的最大值，再繼續延長提取時間，多糖得率變化不顯著(p>0.05)，多糖提取效率反而降低，此外，酶解時間過長，酶催化活性減弱反而對多糖提取不利，考慮實際生產效率。因此，本研究選擇80min為最佳酶解時間。
2.3地桃花多糖的體外抗氧化活性
2.3.1地桃花多糖對DPPH自由基的清除作用由圖7可知，當地桃花多糖濃度在0.2～10mg/mL時，對DPPH自由基清除率不斷增大，當質量濃度為10mg/mL時，地桃花多糖對DPPH自由基清除率為90.06%，而維生素C對DPPH自由基清除率可達94.12%，地桃花多糖清除DPPH自由基的半數抑制濃度IC50為1.082mg/mL，維生素C的IC50為0.643mg/mL，兩者比較，地桃花多糖清除能力較弱于維生素C。以上結果提示地桃花多糖具有較好的DPPH自由基清除作用。
2.3.2地桃花多糖對·OH清除作用由圖8可知，當地桃花多糖濃度在0.2～10mg/mL時，對·OH清除率穩步提升，而維生素C在濃度4mg/mL時對·OH清除率就已達到最大值，之后趨于穩定。當質量濃度為10mg/mL時，地桃花多糖對·OH清除率為89.75%，維生素C對·OH清除率可達96.38%，地桃花多糖清除·OH的IC50為3.202mg/mL，維生素C的IC50為0.368mg/mL，兩者比較，維生素C清除能力強于地桃花多糖。以上結果說明，地桃花多糖具有較好的·OH清除作用。
3討論與結論
本研究在單因素實驗基礎上，通過響應面優化試驗考察了地桃花多糖纖維素酶提取的工藝。結果發現，纖維素酶添加量對地桃花多糖得率影響最大，其次是酶解時間和液料比，而酶解溫度對其多糖提取影響最小;地桃花多糖最佳酶解提取條件為酶添加量10.8mg/mL、酶解時間72min、液料比7∶1mL/g、酶解溫度43℃、pH=5.0，在此條件下地桃花多糖的得率為13.32%，與回歸模型方程預測值13.37%相比，相對誤差小于5%。藍峻峰等[14]探討超聲波法輔助半仿生法提取地桃花中多糖的最佳工藝，采用半仿生提取，在超聲波協同作用的基礎上，以正交試驗法考察超聲功率、超聲時間、超聲溫度等因素對多糖得率的影響，結果獲得地桃花多糖得率為12.86%，稍小于本研究中的多糖得率，本研究酶法提取溫度43℃明顯低于其提取溫度75℃，節約能源，且不需要大型設備，液料比明顯減小，可一定程度上提高生產效率。
體外抗氧化活性試驗表明，地桃花多糖對DPPH自由基、·OH均具有較強的清除能力，在本實驗質量濃度下，其對兩種自由基的清除能力均呈現一定的正相關關系。地桃花多糖清除DPPH自由基的IC50為1.082mg/mL，清除·OH的IC50為3.202mg/mL。但與維生素C比較，地桃花多糖清除兩種自由基的能力較弱。薛井中等也研究地桃花水提取物清除·OH和DPPH自由基、及抑制油脂氧化的能力，結果表明地桃花提取物各部位均有一定的抗氧化能力，但抗氧化活性都弱于維生素C[17]，與本研究結果一致。以上結果為地桃花功能成分的研究開發提供一定的前期理論基礎。
SCISSCIAHCI
