發布時間：2020-02-13所屬分類：科技論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：建立溫度、料液比、提取時間三個單因素系統，以吸光度為指標，確定三個最佳單因素條件，再經過多次實驗建立響應面法水提多糖的模型，探究黃柏多糖的最佳提取工藝和研究其抗氧化能力。結果：確定最佳提取條件為3.0h，提取溫度68℃，液料比30mL/g，在此
摘要：建立溫度、料液比、提取時間三個單因素系統，以吸光度為指標，確定三個最佳單因素條件，再經過多次實驗建立響應面法水提多糖的模型，探究黃柏多糖的最佳提取工藝和研究其抗氧化能力。結果：確定最佳提取條件為3.0h，提取溫度68℃，液料比30mL/g，在此條件下，多糖的最高提取得率為77.3%。經過純化可使黃柏多糖的含量達到80%以上。黃柏多糖對ABTS+清除能力較好。
關鍵詞：黃柏;多糖;響應面法;抗氧化
1引言
黃柏(PhellodendronchinenseSchneid.)，為蕓香科植物黃檗或黃皮樹的干燥樹皮。在我國中醫用藥歷史上，黃柏是一種重要的常用中藥材，其追根溯源可至《神農本草經》[1]，主要分布于東北三省、四川、云南、貴州、湖北和廣西等地[2]。傳統中醫認為，黃柏能清熱燥濕、瀉火解毒、消腫祛腐，臨床上可用于治療黃疸、帶下、熱淋、痔漏，盜汗、遺精以及風疹瘙癢[3]。現代藥理學認為，黃柏在抗腫瘤[4]、降血糖[5]、降血壓[6]、增強免疫[7]、抗氧化[8]、抗潰瘍[9]和抗痛風[10]等方面均有顯著功效。根據研究表明，多糖具有抗腫瘤、抗氧化和增強免疫力等生理活性。而多糖的這些生理活性與黃柏的藥理作用有部分重合。近年來，關于黃柏的藥理作用研究報道較多，植物來源雖不相同，但都證明黃柏有著良好的藥理作用[11]。王海茹[12]等以黃柏花粉為研究對象，采用不同的除蛋白方法提取多糖，再對其抗氧化能力進行比較。甄鏵[13]等采用超聲波技術輔助提取多糖，并通過設計正交實驗優化提取工藝。但目前少有研究通過響應面法優化黃柏多糖的提取工藝以及其抗氧化能力的測定，因此我們對黃柏多糖進行研究，這也將為黃柏藥理作用的探索拓展新方向。
2材料與方法
2.1材料
黃柏粉末，苯酚(菏澤瑞晟化工有限公司);95%乙醇(河南拓邦化工有限公司);氯仿(貴陽新峰化工有限公司);正丁醇(武漢鑫中興有限公司);葡萄糖(國藥集團試劑有限公司);濃硫酸(國藥集團試劑有限公司);七水合硫酸亞鐵(武漢興亞生物有限公司);四水合氯化亞鐵(南京化學試劑有限公司);過硫酸鉀(啟東宏程化工有限公司);水楊酸(國藥集團試劑有限公司);雙氧水(鄭州佳榮化工有限公司);菲啰嗪(上海君瑞生物有限公司);ABTS(酷爾化學科技有限公司);TRIS-HCL緩沖液(杭州聯科生物有限公司)和鄰苯三酚(南京化學試劑有限公司)等均為國產分析純。
2.2儀器與設備
高速萬能粉碎機ModelSF-2000(上海中藥材器械公司);AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);HHS-2S電子恒溫不銹鋼水浴鍋(上海光地儀器設備有限公司)、D2F-6020型真空干燥箱(上海新苗醫療器械制造有限公司);高速離心機LG10-2.4A(上海精密實驗設備有限公司);UV-240IPC紫外分光光度計(上海光譜儀器有限公司)。
2.3實驗方法
2.3.1黃柏的預處理
將干燥后的黃柏藥材放入粉碎機中粉碎，所得粉末過100目篩子，得到黃柏細粉[14]。
2.3.2樣品溶液的制備、多糖的提取和黃柏多糖含量的檢測
稱取黃柏粉末20g，按照料液比1∶20的比例加入400mL體積分數為95%的乙醇，在70℃水浴2h后合并上清液。再利用大孔樹脂除去多糖提取液的色素[15]，收集除去色素后的液體，然后濃縮直至150mL，再以等體積sevage溶液(氯仿∶正丁醇=3∶1)混合均勻后除去濃縮液中的蛋白質，得到多糖溶液，再加入4倍體積的95%乙醇，混合均勻，放入4℃環境內靜置12h，離心，取下方沉淀的固體，放入真空干燥箱，在真空中干燥至無水分或含少量水分為止。運用苯酚―硫酸比色分光光度法測定其吸光度值并計算黃柏多糖得率。
2.3.3單因素試驗
單因素實驗采用控制變量法，研究不同的單因素X1(料液比)、X2(提取時間)和X3(提取溫度)對黃柏多糖提取的影響，在單因素分析基礎上，確定3個單因素的最適水平值，進行響應面優化試驗。
2.3.4響應面優化試驗
以吸光度為評價指標，考察X1(料液比)、X2(提取時間)和X3(提取溫度)對黃柏多糖含量得影響，進一步通過Box-Expert的中心組合試驗優化多糖含量的提取工藝。數據處理采用Design-Ex-pert8.0.6軟件。
2.3.5抗氧化實驗
通過研究黃柏多糖對Fe2+的還原能力和對ABTS+的清除能力，從而根據吸光度的差異可計算出其清除活性基團的清除率，而清除率的大小恰能反映出多糖抗氧化能力的強弱。
(1)還原能力測定：將多糖溶液配置成1mg/mL、2mg/mL，4mg/mL，8mg/mL的溶液，各自取500μL多糖溶液于試管，加入50μL氯化亞鐵，100μL的菲啰嗪溶液，1.35mL的蒸餾水，充分反應，在波長為562nm處測定吸光度，此處吸光度為A1。清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%，A0為對照組的吸光度(蒸餾水代替樣品);A2為樣品本底的吸光度(蒸餾水代替氯化亞鐵溶液)。
(2)ABTS+清除能力測定：取配置好1mg/mL，2mg/mL，4mg/mL，8mg/mL的多糖溶液各400μL，加入1600μL的ABTS+，在室溫下反應10min，于波長734nm處測定吸光度，此處吸光度為A1。清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%，A0為對照組吸光度(蒸餾水代替樣品);A2為樣品本底吸光度(蒸餾水代替ABTS+儲備液)。
3結果與分析
3.1黃柏多糖提取工藝條件單因素試驗
結果和響應面優化實驗 經過單因素實驗，確定單因素的最佳條件分別為，料液比1∶30，提取時間3h，提取溫度70℃時，在此條件下，吸光度為最大值。以吸光度為評價指標，考察X1(料液比)、X2(提取時間)和X3(提取溫度)對黃柏多糖含量的影響，如表1所示。
表2數據可以構建出響應面模型：響應值為測得的吸光度的數值，三個因素為另外三個坐標軸，經過響應面軟件的數據整合得出回歸方程如下：Y=-0.43125+0.020918X1+0.11093X2+0.02107X3-0.0001X1X2-0.0000625X1X3-0.000025X2X3-0.000273X12-0.0173X22-0.0001405X32，對得到的結果作方差分析，結果如表3所示。
根據表3的數據，X3對響應面的作用極其顯著，X2的作用為顯著，X1X3的作用為高度顯著，而且X12，X22，X32對響應面的作用都是極其顯著，整個模型的P值也是小于0.001，作用為極其顯著，實驗的失擬項P值為0.35，作用為不顯著，以上所有分析說明整個響應面系統的建立和實驗優化條件是具備可行性的。判定系數R2為0.9917說明模型的建立很準確，模型校正判定系數RAdj2為0.9811，表示此模型可以預測和解釋98.11%的實驗數據，信噪比Adeqprecisior為26.072，證明此模型可以以用來預測實驗結果。綜上，響應面系統是準確的，可以用來預測和分析實驗結果。
3.2響應面交互作用的分析
響應面三個單因素，可以產生三種兩兩交互作用的組合，分別是液料比和溫度、液料比和時間、時間和溫度。通過響應面軟件可以繪出這三種交互組合的響應面分析圖，借此可以非常清晰的看出響應面的交互影響，結果如圖1―圖3所示。
通過響應面優化提取黃柏多糖的提取條件，黃柏多糖的最佳提取條件為：料液比1∶30，提取溫度68℃，提取時間3h。在此條件下，吸光度數值預測為0.7692，而五組平行驗證實驗所測得的吸光度數據分別為：0.759，0.769，0.773，0.762，0.767，五組數據的平均值為0.766。對平均值和預測值作結果分析，吻合度為99.58%，相對誤差僅為0.42%，證明了模型的可靠性。
3.3抗氧化作用的分析
通過對黃柏多糖的還原能力和對ABTS+的清除能力進行分析后，結果如圖4所示。
由圖4可以看出，黃柏多糖具有一定的還原能力和對ABTS+的清除能力，且清除作用具有濃度依賴性。黃柏多糖的還原能力在4mg/mL時達到峰值，清除效果一般。黃柏多糖對ABTS+的清除率較高，并且在清除率的變化趨勢上是隨著多糖樣品液的濃度升高而先增后減。多糖樣品液濃度在4mg/mL時清除ABTS+的清除率達到最大峰值45.7%。
4結論
黃柏多糖的研究少有人涉及，本實驗采取響應面法優化提取黃柏多糖，最后得出水提法提取黃柏多糖的最佳條件是：提取溫度68℃、料液比1∶30、提取時間3h。在此條件下，吸光度數值預測為0.7692，驗證實驗的平均值為0.766，相對誤差僅為0.42%，證明了模型的可靠性。研究得出黃柏多糖在一定濃度下具有還原能力，并且在濃度為4mg/mL時還原力最強。而黃柏多糖對ABTS+的清除效果較好，在濃度為4mg/mL時，其對ABTS+的清除效果最好，這可以為黃柏多糖的抗氧化研究提供理論基礎。
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