發(fā)布時(shí)間:2020-02-13所屬分類:科技論文瀏覽:1次
摘 要: 摘要:建立溫度、料液比、提取時(shí)間三個(gè)單因素系統(tǒng),以吸光度為指標(biāo),確定三個(gè)最佳單因素條件,再經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)建立響應(yīng)面法水提多糖的模型,探究黃柏多糖的最佳提取工藝和研究其抗氧化能力。結(jié)果:確定最佳提取條件為3.0h,提取溫度68℃,液料比30mL/g,在此
摘要:建立溫度、料液比、提取時(shí)間三個(gè)單因素系統(tǒng),以吸光度為指標(biāo),確定三個(gè)最佳單因素條件,再經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)建立響應(yīng)面法水提多糖的模型,探究黃柏多糖的最佳提取工藝和研究其抗氧化能力。結(jié)果:確定最佳提取條件為3.0h,提取溫度68℃,液料比30mL/g,在此條件下,多糖的最高提取得率為77.3%。經(jīng)過(guò)純化可使黃柏多糖的含量達(dá)到80%以上。黃柏多糖對(duì)ABTS+清除能力較好。
關(guān)鍵詞:黃柏;多糖;響應(yīng)面法;抗氧化
1引言
黃柏(PhellodendronchinenseSchneid.),為蕓香科植物黃檗或黃皮樹的干燥樹皮。在我國(guó)中醫(yī)用藥歷史上,黃柏是一種重要的常用中藥材,其追根溯源可至《神農(nóng)本草經(jīng)》[1],主要分布于東北三省、四川、云南、貴州、湖北和廣西等地[2]。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為,黃柏能清熱燥濕、瀉火解毒、消腫祛腐,臨床上可用于治療黃疸、帶下、熱淋、痔漏,盜汗、遺精以及風(fēng)疹瘙癢[3]。現(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為,黃柏在抗腫瘤[4]、降血糖[5]、降血壓[6]、增強(qiáng)免疫[7]、抗氧化[8]、抗?jié)僛9]和抗痛風(fēng)[10]等方面均有顯著功效。根據(jù)研究表明,多糖具有抗腫瘤、抗氧化和增強(qiáng)免疫力等生理活性。而多糖的這些生理活性與黃柏的藥理作用有部分重合。近年來(lái),關(guān)于黃柏的藥理作用研究報(bào)道較多,植物來(lái)源雖不相同,但都證明黃柏有著良好的藥理作用[11]。王海茹[12]等以黃柏花粉為研究對(duì)象,采用不同的除蛋白方法提取多糖,再對(duì)其抗氧化能力進(jìn)行比較。甄鏵[13]等采用超聲波技術(shù)輔助提取多糖,并通過(guò)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。但目前少有研究通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化黃柏多糖的提取工藝以及其抗氧化能力的測(cè)定,因此我們對(duì)黃柏多糖進(jìn)行研究,這也將為黃柏藥理作用的探索拓展新方向。
2材料與方法
2.1材料
黃柏粉末,苯酚(菏澤瑞晟化工有限公司);95%乙醇(河南拓邦化工有限公司);氯仿(貴陽(yáng)新峰化工有限公司);正丁醇(武漢鑫中興有限公司);葡萄糖(國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司);濃硫酸(國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司);七水合硫酸亞鐵(武漢興亞生物有限公司);四水合氯化亞鐵(南京化學(xué)試劑有限公司);過(guò)硫酸鉀(啟東宏程化工有限公司);水楊酸(國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司);雙氧水(鄭州佳榮化工有限公司);菲啰嗪(上海君瑞生物有限公司);ABTS(酷爾化學(xué)科技有限公司);TRIS-HCL緩沖液(杭州聯(lián)科生物有限公司)和鄰苯三酚(南京化學(xué)試劑有限公司)等均為國(guó)產(chǎn)分析純。
2.2儀器與設(shè)備
高速萬(wàn)能粉碎機(jī)ModelSF-2000(上海中藥材器械公司);AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);HHS-2S電子恒溫不銹鋼水浴鍋(上海光地儀器設(shè)備有限公司)、D2F-6020型真空干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);高速離心機(jī)LG10-2.4A(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);UV-240IPC紫外分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)。
2.3實(shí)驗(yàn)方法
2.3.1黃柏的預(yù)處理
將干燥后的黃柏藥材放入粉碎機(jī)中粉碎,所得粉末過(guò)100目篩子,得到黃柏細(xì)粉[14]。
2.3.2樣品溶液的制備、多糖的提取和黃柏多糖含量的檢測(cè)
稱取黃柏粉末20g,按照料液比1∶20的比例加入400mL體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇,在70℃水浴2h后合并上清液。再利用大孔樹脂除去多糖提取液的色素[15],收集除去色素后的液體,然后濃縮直至150mL,再以等體積sevage溶液(氯仿∶正丁醇=3∶1)混合均勻后除去濃縮液中的蛋白質(zhì),得到多糖溶液,再加入4倍體積的95%乙醇,混合均勻,放入4℃環(huán)境內(nèi)靜置12h,離心,取下方沉淀的固體,放入真空干燥箱,在真空中干燥至無(wú)水分或含少量水分為止。運(yùn)用苯酚―硫酸比色分光光度法測(cè)定其吸光度值并計(jì)算黃柏多糖得率。
2.3.3單因素試驗(yàn)
單因素實(shí)驗(yàn)采用控制變量法,研究不同的單因素X1(料液比)、X2(提取時(shí)間)和X3(提取溫度)對(duì)黃柏多糖提取的影響,在單因素分析基礎(chǔ)上,確定3個(gè)單因素的最適水平值,進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。
2.3.4響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)
以吸光度為評(píng)價(jià)指標(biāo),考察X1(料液比)、X2(提取時(shí)間)和X3(提取溫度)對(duì)黃柏多糖含量得影響,進(jìn)一步通過(guò)Box-Expert的中心組合試驗(yàn)優(yōu)化多糖含量的提取工藝。數(shù)據(jù)處理采用Design-Ex-pert8.0.6軟件。
2.3.5抗氧化實(shí)驗(yàn)
通過(guò)研究黃柏多糖對(duì)Fe2+的還原能力和對(duì)ABTS+的清除能力,從而根據(jù)吸光度的差異可計(jì)算出其清除活性基團(tuán)的清除率,而清除率的大小恰能反映出多糖抗氧化能力的強(qiáng)弱。
(1)還原能力測(cè)定:將多糖溶液配置成1mg/mL、2mg/mL,4mg/mL,8mg/mL的溶液,各自取500μL多糖溶液于試管,加入50μL氯化亞鐵,100μL的菲啰嗪溶液,1.35mL的蒸餾水,充分反應(yīng),在波長(zhǎng)為562nm處測(cè)定吸光度,此處吸光度為A1。清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%,A0為對(duì)照組的吸光度(蒸餾水代替樣品);A2為樣品本底的吸光度(蒸餾水代替氯化亞鐵溶液)。
(2)ABTS+清除能力測(cè)定:取配置好1mg/mL,2mg/mL,4mg/mL,8mg/mL的多糖溶液各400μL,加入1600μL的ABTS+,在室溫下反應(yīng)10min,于波長(zhǎng)734nm處測(cè)定吸光度,此處吸光度為A1。清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%,A0為對(duì)照組吸光度(蒸餾水代替樣品);A2為樣品本底吸光度(蒸餾水代替ABTS+儲(chǔ)備液)。
3結(jié)果與分析
3.1黃柏多糖提取工藝條件單因素試驗(yàn)
結(jié)果和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 經(jīng)過(guò)單因素實(shí)驗(yàn),確定單因素的最佳條件分別為,料液比1∶30,提取時(shí)間3h,提取溫度70℃時(shí),在此條件下,吸光度為最大值。以吸光度為評(píng)價(jià)指標(biāo),考察X1(料液比)、X2(提取時(shí)間)和X3(提取溫度)對(duì)黃柏多糖含量的影響,如表1所示。
表2數(shù)據(jù)可以構(gòu)建出響應(yīng)面模型:響應(yīng)值為測(cè)得的吸光度的數(shù)值,三個(gè)因素為另外三個(gè)坐標(biāo)軸,經(jīng)過(guò)響應(yīng)面軟件的數(shù)據(jù)整合得出回歸方程如下:Y=-0.43125+0.020918X1+0.11093X2+0.02107X3-0.0001X1X2-0.0000625X1X3-0.000025X2X3-0.000273X12-0.0173X22-0.0001405X32,對(duì)得到的結(jié)果作方差分析,結(jié)果如表3所示。
根據(jù)表3的數(shù)據(jù),X3對(duì)響應(yīng)面的作用極其顯著,X2的作用為顯著,X1X3的作用為高度顯著,而且X12,X22,X32對(duì)響應(yīng)面的作用都是極其顯著,整個(gè)模型的P值也是小于0.001,作用為極其顯著,實(shí)驗(yàn)的失擬項(xiàng)P值為0.35,作用為不顯著,以上所有分析說(shuō)明整個(gè)響應(yīng)面系統(tǒng)的建立和實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件是具備可行性的。判定系數(shù)R2為0.9917說(shuō)明模型的建立很準(zhǔn)確,模型校正判定系數(shù)RAdj2為0.9811,表示此模型可以預(yù)測(cè)和解釋98.11%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),信噪比Adeqprecisior為26.072,證明此模型可以以用來(lái)預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。綜上,響應(yīng)面系統(tǒng)是準(zhǔn)確的,可以用來(lái)預(yù)測(cè)和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
3.2響應(yīng)面交互作用的分析
響應(yīng)面三個(gè)單因素,可以產(chǎn)生三種兩兩交互作用的組合,分別是液料比和溫度、液料比和時(shí)間、時(shí)間和溫度。通過(guò)響應(yīng)面軟件可以繪出這三種交互組合的響應(yīng)面分析圖,借此可以非常清晰的看出響應(yīng)面的交互影響,結(jié)果如圖1―圖3所示。
通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化提取黃柏多糖的提取條件,黃柏多糖的最佳提取條件為:料液比1∶30,提取溫度68℃,提取時(shí)間3h。在此條件下,吸光度數(shù)值預(yù)測(cè)為0.7692,而五組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的吸光度數(shù)據(jù)分別為:0.759,0.769,0.773,0.762,0.767,五組數(shù)據(jù)的平均值為0.766。對(duì)平均值和預(yù)測(cè)值作結(jié)果分析,吻合度為99.58%,相對(duì)誤差僅為0.42%,證明了模型的可靠性。
3.3抗氧化作用的分析
通過(guò)對(duì)黃柏多糖的還原能力和對(duì)ABTS+的清除能力進(jìn)行分析后,結(jié)果如圖4所示。
由圖4可以看出,黃柏多糖具有一定的還原能力和對(duì)ABTS+的清除能力,且清除作用具有濃度依賴性。黃柏多糖的還原能力在4mg/mL時(shí)達(dá)到峰值,清除效果一般。黃柏多糖對(duì)ABTS+的清除率較高,并且在清除率的變化趨勢(shì)上是隨著多糖樣品液的濃度升高而先增后減。多糖樣品液濃度在4mg/mL時(shí)清除ABTS+的清除率達(dá)到最大峰值45.7%。
4結(jié)論
黃柏多糖的研究少有人涉及,本實(shí)驗(yàn)采取響應(yīng)面法優(yōu)化提取黃柏多糖,最后得出水提法提取黃柏多糖的最佳條件是:提取溫度68℃、料液比1∶30、提取時(shí)間3h。在此條件下,吸光度數(shù)值預(yù)測(cè)為0.7692,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的平均值為0.766,相對(duì)誤差僅為0.42%,證明了模型的可靠性。研究得出黃柏多糖在一定濃度下具有還原能力,并且在濃度為4mg/mL時(shí)還原力最強(qiáng)。而黃柏多糖對(duì)ABTS+的清除效果較好,在濃度為4mg/mL時(shí),其對(duì)ABTS+的清除效果最好,這可以為黃柏多糖的抗氧化研究提供理論基礎(chǔ)。
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