發布時間：2020-04-23所屬分類：醫學論文瀏覽：1次
摘 要： [摘要]目的：研究中藥單體柚皮苷(NG)對體外培養的大鼠骨髓間充質干細胞(MSCs)向成骨細胞分化過程中MAPK信號通路的影響。方法：觀察在正常、加入p38、ERK和JNK通路抑制劑SB203580、PD98059、SP600125及3種抑制劑全部加入的情況下，各組堿性磷酸酶(AIJP)、骨鈣
[摘要]目的：研究中藥單體柚皮苷(NG)對體外培養的大鼠骨髓間充質干細胞(MSCs)向成骨細胞分化過程中MAPK信號通路的影響。方法：觀察在正常、加入p38、ERK和JNK通路抑制劑SB203580、PD98059、SP600125及3種抑制劑全部加入的情況下，各組堿性磷酸酶(AIJP)、骨鈣素(BGP)、I型膠原(ColI)等骨向分化指標的差異。用Westernblotting技術檢測各組p38、ERK1/2和JNK蛋白的磷酸化水平，用熒光定量PCR技術檢測細胞因子轉化生長因子B(TGF一13。)、骨形成蛋白2(BMP一2)和核心結合因子ctl(Cbfet1)mRNA的表達。結果：(1)10mol/L為本實驗中NG的最佳促骨向分化濃度。(2)NG最佳濃度組的ALP和BGP含量比其它各組都高(P<0.05)，ColI含量無明顯差異(P>0.05);與NG組相比，加入不同抑制劑組的AIjP、BGP和ColI表達量出現不同程度的降低。(3)與空白組相比，NG組JNK蛋白的磷酸化水平升高(P<0.05)，p38蛋白的磷酸化水平降低(P<0.O1)，ERK1/2蛋白的磷酸化水平無明顯差異(P>0.05)。與NG組相比，加入不同抑制劑組的p38、ERK1/2和JNK蛋白的磷酸化水平有升高也有降低。(4)NG組上調BMP一2的表達(P<0.05)，下調Cbfcd的表達(P<0.05)，而對TGF—B。的表達無明顯影響(P>0.05)。與NG組相比，加入不同抑制劑組的TGF—p1、BMP一2和CbfctlmRNA表達量出現不同程度的降低。結論：NG主要通過激活MAPK信號通路中ERK通路、JNK通路以及上調BMP一2的表達，促進MSCs的骨向分化。NG上調BMP一2的表達受MAPK通路中p38通路的影響較大。
[關鍵詞]柚皮苷;骨髓間充質干細胞;骨向分化;MAPK信號通路
骨髓間充質干細胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是在骨髓中發現的一種起源于中胚層、具有自我復制能力和多向分化潛能的非造血干細胞。MSCs向成骨細胞(osteoblast，OB)分化的特性可為骨生長及骨修復提供細胞來源，在骨性疾病的治療上擁有非常良好的應用前景。MSCs向OB分化是個復雜的過程，涉及多種信號通路的調控，其中與絲裂原活化蛋白激酶(mitogen—activatedproteinkinase，MAPK)信號轉導途徑關系密切。已有研究表明，MAPK通路中的細胞外信號調節激酶(extracellular—signalregulatedproteinkinase，ERK)、p38MAPK和c—Jun氨基末端激酶(C—JunN—terminalkinase，JNK)通路參與了OB分化增殖的信號轉導，并在應激、凋亡及骨質代謝、炎癥中發揮重要作用…。
柚皮苷(naringin，NG)作為中藥骨碎補主要成分之一，大量存在于柚、葡萄柚和酸橙及其變種的果皮及果實中。NG具有促進OB增殖和分化、抗過敏、抗炎、抗病毒、抗氧化、降血脂、抑癌等多種藥理活性_2J。在促進MSCs骨向分化方面雖然已有文獻進行了初步研究J，但其作用機制尚不清楚。本研究采用中藥單體NG對SD大鼠MSCs進行干預，觀察在NG促MSCs骨向分化過程中ERK、p38和JNK通路的作用及與骨轉化調控因子之間的關系。
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材料和方法
1動物
清潔級(SPF)Spragne—Dawley(SD)大鼠，雌性，3月齡，體重200g左右，購自南方醫科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(粵)2o06—0015。
2主要儀器和試劑
倒置相差顯微鏡(Olympus);CO2培養箱(Rev—CO);酶標儀(Bio—Rad);數碼照相機(Gallon);掃描電子顯微鏡(Philips);PCR儀、穩壓恒流電泳儀、IQ5RealTimePCRDetectionSystem(Bio—Rad)。
—MEM(HyClone);胎牛血清(Gibco);胰蛋白酶、TritonX一100(Amreseo);噻唑藍(Mar)、DMSO、pNPP(Sigma);SB203580(SB，p38通路抑制劑)、PD98059(PD，ERK通路抑制劑)、SP600125(SP,JNK通路抑制劑)購自碧云天生物技術研究所;BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術研究所;大鼠骨鈣素(boneglaprotein，BGP)EHSA檢測試劑盒、大鼠膠原酶I(collagenaseI，ColI)ELISA檢測試劑盒、堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)測定試劑盒購自南京建成生物研究所;兔多克隆I抗(CellSignaling)，辣根過氧化物酶(ho~eradishperoxidase，HRP)標記的Ⅱ抗(CellSignaling)，Trizol(Invitro.gen);氯仿、異丙醇(廣州化學試劑廠);Taq酶、反轉錄酶購自大連寶生物工程有限公司;引物由上海生工合成;柚皮苷購自中國藥品生物制品檢定所;其余試劑均為國產分析純。
制備NG母液并設置不同濃度梯度一J。取l0mgNG溶于85LDMSO溶液中配制成0.2moUL母液。用僅一MEM完全培養基稀釋母液，分別得到濃度為1×10一mot/L、1X10～mot/L、1×10mot/L、1X10～mol//L、1X10～moVL、1X10一mot/L和1X10mot/L的NG溶液。
3方法
3.1原代MSCs的分離提取與鑒定全骨髓貼壁法提取大鼠MSCs。3月齡SD雌性大鼠，頸椎脫臼法處死，置75%乙醇中浸泡10min。無菌條件下迅速分離出雙側股骨，剔凈股骨上附著的脂肪結締組織和骨膜，迅速移人超凈臺。將分離好的股骨放入75%乙醇中浸泡30S，隨后用D—Hanks緩沖鹽溶液沖洗4～5次，放人無菌培養皿內，剪去股骨兩頭的干骺端。用5mL注射器吸取含10%FBS的完全培養基反復沖洗骨髓腔數次，收集沖出液，用吸管充分吹打均勻，得到細胞懸液。用1mL注射器將細胞懸液按1×10cells/L的密度接種到25cm塑料培養瓶中，置37℃、5%CO、飽和濕度的培養箱中培養。24h半量換液1次，以后每3d全量換液1次。待貼壁細胞達到80%一90%融合后，傳代培養。雜細胞隨換液而被逐漸棄除，據差速貼壁原理，MSCs不斷純化。倒置顯微鏡下觀察細胞形態特征，用流式細胞儀檢測細胞表面標志抗原CD29、CD34和CD45，并用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察細胞超微結構。
3.2細胞增殖活性測定取生長狀態良好的P3代MSCs，0.25%胰酶消化后，制成單細胞懸液，以2x10"cell/)密度接種于96孔板中，每孔中的體積分別為100L，24h待所有細胞貼壁后，吸出每孔培養液，換成無血清培養基，24h細胞周期同步化后開始添加不同濃度柚皮苷。吸凈每孔培養液，取配制好的不同濃度的柚皮苷工作液，按設置的濃度加入不同組別，使各組的終濃度分別為1x10-3mo/L、1x10-molL.1x10-smol/L，1x10-6molL.1x10-7mol/L，1x10-"mol/L，1x10-mol/L，空白組中僅加入完全培養基，不加NG溶液作為對照。每個濃度設6個復孔，每孔終體積200L。各組添加不同濃度柚皮背后培養3d，進行MTT檢測。棄去培養液，D-Hanks液沖洗3次，更換無血清的a-MEM培養基180L/well，同時加入5g/LMTT20LL/well，置37 ℃5%CO2培養箱中孵育4h后，小心棄去上清液，加人DMSO150uL/well，置微孔板振蕩器上振蕩10min，在酶標儀上測吸光度(A)值，測量波長為490nm，以未接種細胞的空白對照孔作為調零孔。
3.3以ALP活性確定NG最佳促骨向分化濃度采用pNPP法檢測不同濃度NG對MSCs分化中ALP活性的影響。取P3代細胞，以5x10'cella/LI密度接種到6孔板中，每孔3mL。用含10%FBS的a-MEM培養基培養6d，更換無血清培養基培養24h24h細胞周期同步化后，更換為含有不同濃度NG的完全培養基。培養72h后，吸棄孔中的培養基，用D -Hanks洗2遍。每孔加入細胞裂解液(0.1%Tritonx-100)1mL，4℃作用20min。收集裂解液采用對硝基酚磷酸鹽法測定ALP濃度。以pNPP為底物，根據水解磷酯鍵所產生的對硝基酚量測定酶活力。在37C、pH10.0條件下，每分鐘轉化產生1umol/L對硝基酚的酶量為1個酶單位。用BCA法測定裂解液中總蛋白濃度，以蛋白含量(ug)為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪出標準曲線。根據標準曲線，算出樣品實際濃度(g/L)，ALP活性以10U/gprotein表示。
3.4實驗分組及各項指標檢測確定NG最佳促MSCa骨向分化濃度后，以該濃度NG和通路抑制劑對MSCs進行干預[3-1]。實驗分為6組：(1)空白對照組(control);(2)NG組;(3)NG+SB203580(NG+SB)組;(4)NG+PD98059(NG+PD)組;(5)NG+SP600125(NG+SP)組;(6)NG+3種抑制劑(NG+SB+PD+SP)。實驗取P3代均質性良好的MSCs以1x10"cells/L的密度接種于24孔板，共6組，每組6個復孔。待細胞接種24h后，換入無血清培養基，24h細胞周期同步化后，再加人藥物及完全培養基，每孔終體積1mL。培養板置于37℃，5%co2培養箱中繼續培養：(1)空白對照組每3d正常換液1次;
(2)NG組加人最佳濃度的NG及完全培養基;(3)-(6)組在每次換液前，分別加人3umol/LSB2035804umol/LPD98059和5umol/L.SP600125預處理30min，然后加入最佳濃度的NG及完全培養基繼續培養，加藥后培養3d與其它各組同時取細胞上清液和細胞進行指標檢測。
3.4.1ALP活性測定吸盡各孔培養液，用PBS洗3次，每孔加200uL0.1%TritonX-100，4℃冰上裂解，收集細胞裂解液，取30L加于測定管內，按照ALP試劑盒說明操作，標準管加入30uL酚標準應用液(0.02g/L)，空白管加入雙蒸水30山L，各管均加入緩沖液50L和基質液50uL，充分混勻，37℃水浴15min，加入顯色劑150L，立即混勻，選擇520nm波長，酶標儀測定各管吸光度。根據說明書上相應公式計算ALP活性，用金氏單位(King'su-nit，每克組織蛋白在37℃與基質作用15min產生1mgt為1個金氏單位)表示。
3.4.2BCP分泌測定吸棄孔中的培養液，用PBS洗2遍，每孔加人細胞裂解液200山，冰上裂解20min，收集裂解液-20℃保存待測。標準曲線制備及樣品測定按說明書操作，于酶標儀上450nm波長處測定A值，并通過標準曲線計算樣品中BGP含量，用4e/gprotein表示。
3.4.3Col1含量測定分別取各組的細胞培養上清液，標準曲線制備及樣品測定按說明書操作，于酶標儀上490nm波長處測定A值，并通過標準曲線計算樣品中Col1含量，結果用mg/gprotein表示。
3.4.4Westernbloting檢測磷酸化ERK1/2、磷酸化JNK和磷酸化p38的表達吸棄培養基，用PBS洗2遍，再加入細胞裂解液4℃裂解30min，12000/min離心10min取上清液，用BCA法測蛋白濃度。配制12%分離膠和5%積層膠進行SDS-PAGE電泳，每孔上樣量501go以GAPDH作為內參照。電泳結束后轉膜，將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉，分別加入免抗p38抗體、ERK抗體、JNK抗體、GAPDH抗體、p-p38抗體、p-ERK抗體和P-JNK抗體于4℃孵育過夜。洗膜，加入HRP標記的相應的羊抗兔1gG抗體于室溫孵育1h。洗膜，ECI.顯影曝光，得到膠片，比較各條帶的灰度值，分析所檢測蛋白的磷酸化水平。
3.4.5熒光定量PCR技術檢測TGF-B，、BMP-2和CblalmRNA的表達總RNA的提取采用Trizol法進行，紫外分光光度計檢測濃度，并用1%甲醛變性瓊脂糖電泳檢測其完整性。將其逆轉錄為cDNA以18SrRNA為內參照
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