發布時間：2020-04-23所屬分類：醫學論文瀏覽：1次
摘 要： [摘 要]目的：測定隱球菌性腦膜炎患者中干擾素-(IFN-)和轉化生長因子-(TGF-)表達并分析其臨床意義。方法：在本院2016年1月至2018年10月確診為隱球菌性腦膜炎患者中選取63例納入觀察組，并選取同期60名健康體檢者，納入正常對照組。測定兩組受試者入組時外周
[摘 要]目的：測定隱球菌性腦膜炎患者中干擾素-γ(IFN-γ)和轉化生長因子-β(TGF-β)表達并分析其臨床意義。方法：在本院2016年1月至2018年10月確診為隱球菌性腦膜炎患者中選取63例納入觀察組，并選取同期60名健康體檢者，納入正常對照組。測定兩組受試者入組時外周血CD4+T細胞中輔助T細胞(Th細胞)相關細胞因子表達水平，包括IFN-γ、TGF-β及白細胞介素-4(IL-4)、IL-6、IL-9、IL-17，并對比觀察組治療前后上述指標變化，分析各指標間相關性。結果：觀察組治療后TGF-β、IL-6、IL-17表達水平均較治療前升高，其治療前后IFN-γ表達水平均高于正常對照組，TGF-β表達水平均低于正常對照組;觀察組治療前IL-9、IL-17表達水平低于正常對照組，其治療后IL-6高于正常對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。觀察組63例患者中，共有42例于治療3周后完全應答或部分應答，應答率為66.67%。剔除未應答患者后對比有應答組與正常對照組Th相關細胞因子表達水平，結果顯示，有應答組治療前IFN-γ表達水平高于正常對照組，IL-17表達水平低于正常對照組，其治療后IFN-γ、TGF-β、IL-6、IL-9、IL-17表達水平均高于正常對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。Pearson相關性分析示，觀察組TGF-β表達水平與IL-9、IL-17均呈正相關，r值分別為0.829、0.781，其IL-6、IL-17表達水平亦呈正相關，r值為0.880(P<0.05)。結論：隱球菌感染初期TGF-β抑制可能是導致患者病情加劇的主要原因，而TGF-β誘導Th17細胞分化及促進IL-17分泌功能對于控制患者病情進展有積極作用。
[關鍵詞] 隱球菌性腦膜炎;干擾素-γ;轉化生長因子-β;細胞因子
隱球菌性腦膜炎屬中樞神經系統隱球菌感染性疾病，具有起病隱匿、病程長等特點，致殘、致死率均處于較高水平[1]。該病好發于免疫功能低下人群，如人免疫缺陷病毒(HIV)感染者、器官移植者等，故多數研究均認為機體免疫功能在抵御隱球菌感染中發揮了重要的作用[2]。T淋巴細胞相關免疫狀態與機體免疫功能具有密切關聯，輔助T細胞(Th細胞)在機體體液免疫、細胞免疫功能調節中均發揮著重要作用，其中，Th1細胞主要產生干擾素-γ(IFN-γ)、白細胞介素-12(IL-12)等，被證實能夠抑制隱球菌的生長與擴散[3];Th17細胞分泌的IL-17及與Th17分化相關的轉化生長因子-β(TGF-β)，也可能在隱球菌感染時發揮重要的調控作用[4]。此次研究就隱球菌性腦膜炎患者外周血IFN-γ和TGF-β表達特點進行了分析，旨在了解Th1、Th17細胞在隱球菌性腦膜炎發病機制中的作用。
1 資料與方法
1.1 一般資料
自我院2016年1月至2018年10月確診為隱球菌性腦膜炎患者中選取63例，納入觀察組。納入標準：患者無化療和放療史，未合并自身免疫性疾病，HIV感染檢測結果呈陰性，無器官移植。63例患者中，男40例，女23例，年齡21~67歲，平均(40.25±11.73)歲，病程7~42d，平均(41.59±6.97)d。按照年齡相近、性別相仿原則，選取同期體格檢查、實驗室檢查及影像學檢查均未見異常的健康體檢者60名，納入正常對照組，其中男38名，女22名，年齡25~63歲，平均(38.87±12.05)歲。此次研究已獲取我院醫學倫理委員會批準，受試者均知情同意并簽署書面協議。
1.2 檢測方法
抽取兩組受試者入組次日晨起空腹外周靜脈血10mL，以20U/mL肝素抗凝，行外周血單個核細胞分離，而后采用磁珠分選細胞分離CD4+T細胞[5]：
(1)使用PBS洗滌細胞懸液，以300g離心10min，棄上清;
(2)每107個細胞加入緩沖液80μL、磁珠分選細胞(MACS)CD420μL，吹打混勻;
(3)4℃避光孵育15min;
(4)加入緩沖液3mL，洗滌細胞;
(5)于4℃環境下以300g離心10min，棄上清，加入緩沖液500μL，懸浮細胞;
(6)將MS分離柱置于MidiMACS分選器內，加入緩沖液500μL，濕柱;
(7)將細胞懸液緩慢加入分選柱，自然析出非CD4+T細胞懸液;
(8)使用500μL緩沖液沖洗MS分離柱3次;
(9)將MS分離柱移出磁場，加入緩沖液1mL，沖出滯留在MS分離柱中的CD4+T細胞;
(10)使用PBS洗滌細胞懸液，以300g離心10min，棄上清，細胞沉淀保存于-70℃環境中。
參照文獻方法[6-7]抽提標本總RNA，逆轉錄合成cDNA，使用實時定量PCR法，測定兩組受試者CD4+T細胞中IFN-γ、TGF-β及IL-4、IL-6、IL-9、IL-17表達水平。
1.3 分析方法
對比觀察組、正常對照組入組時外周血CD4+T細胞中Th相關細胞因子表達水平差異，并于觀察組患者治療3周后再次抽取其外周血，測定CD4+T細胞中IFN-γ、TGF-β及IL-4、IL-6、IL-9、IL-17表達水平并與治療前檢測結果進行對比。此外，根據治療效果，分析剔除治療無效病例后觀察組患者上述指標變化情況，治療效果判斷標準參照文獻[8]，完全應答：臨床癥狀消失，腦脊液墨汁染色涂片計數正常，腦脊液隱球菌培養轉陰，腦脊液乳膠凝集滴度明顯下降，生化正常;部分應答：臨床癥狀好轉，腦脊液常規及生化改善，真菌培養陰性。無應答為出現以下情況之一：臨床癥狀或腦脊液常規、生化惡化或真菌培養陽性。將完全應答和部分應答患者歸為好轉組與正常對照組進行比較。分析Th相關細胞因子的之間的相關性。
1.4 統計學分析
對本臨床研究的所有數據采用SPSS18.0進行分析，IFN-γ、TGF-β表達水平等計量資料以(x±s)表示，并采用t檢驗，相關性分析采用Pearson法，以P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1Th相關細胞因子檢測結果
觀察組治療后TGF-β、IL-6、IL-17表達水平均較治療前升高，其治療前后IFN-γ表達水平均高于正常對照組，TGF-β表達水平均低于正常對照組;觀察組治療前IL-9、IL-17表達水平低于正常對照組，其治療后IL-6高于正常對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。
觀察組63例患者中，共有42例于治療3周后完全應答或部分應答，應答率為66.67%。剔除未應答患者后對比觀察組與正常對照組Th相關細胞因子表達水平，結果顯示，觀察組治療前IFN-γ表達水平高于正常對照組，IL-17表達水平低于正常對照組，其治療后IFN-γ、TGF-β、IL-6、IL-9、IL-17表達水平均高于正常對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。
2.2 相關性分析
Pearson相關性分析示，觀察組TGF-β表達水平與IL-9、IL-17均呈正相關，r值分別為0.829、0.781，其IL-6、IL-17表達水平亦呈正相關，r值為0.880(P<0.05)。
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3 討論
機體對隱球菌細胞介導的免疫反應以直接細胞毒作用和細胞因子介導的調節作用為主，自然殺傷細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞均可直接產生細胞毒作用，但同時也受到細胞因子的調節[9]。Th1細胞主要分泌IFN-γ，同時也可分泌IL-2、IL-18和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，Th2則主要分泌IL-4。多數學者認為，Th1、Th2表達水平處于相對平衡狀態，是機體抵御病原菌感染的重要基礎[10-11]。
動物研究顯示，在隱球菌感染模型中，IFN-γ可通過活化巨噬細胞、刺激巨噬細胞分泌抗菌蛋白、增加兩性霉素B抗菌活性等機制，發揮保護性免疫效應[12]。亦有研究指出，將重組IL-12、IL-18用于播散性隱球菌感染小鼠的治療，能夠有效促進隱球菌在肺部的清除，改善小鼠生存周期[13]。然而，本研究結果示，無論是否剔除未好轉患者，觀察組治療前后IFN-γ表達水平均高于正常對照組，且患者治療前后IFN-γ表達水平未見明顯變化，說明在隱球菌性腦膜炎患者中，IFN-γ的保護作用并不占主導作用，其原因可能為：機體感染隱球菌后，IFN-γ在急性期或慢性期抗隱球菌效應中均可發揮積極作用，但僅有IFN-γ的存在，并不能有效抵御隱球菌感染[14]。
與IFN-γ相比，TGF-β在隱球菌性腦膜炎發生發展中扮演的作用更為重要：一方面，TGF-β在激活后，能夠促進機體抵抗隱球菌效應的上升;另一方面，TGF-β是幼稚T細胞向Th17細胞分化的必需條件，其積極應答狀態也是機體抵御隱球菌感染的關鍵環節[15-16]。此外，在IL-6缺乏的前提下，TGF-β可能誘導幼稚T細胞向調節性T細胞分化，與多種自身免疫性疾病的發生發展亦具有一定關聯[17]。在本次研究中，觀察組治療后TGF-β表達水平較治療前升高，且剔除未好轉患者后，觀察組治療后TGF-β表達水平高于正常對照組，與此同時，TGF-β與IL-17表達水平呈正相關，提示TGF-β誘導IL-17表達上升，可能是促進機體抵御隱球菌感染的重要機制。伴隨著TGF-β表達水平的上升，患者IL-9表達水平亦呈上升趨勢，IL-9也參與了抵抗隱球菌感染的免疫機制。除此之外，隱球菌性腦膜炎患者IL-6、IL-17表達水平亦呈正相關，據此推測，在IL-6存在的條件下，TGF-β可阻斷或破壞Th1、Th2細胞分化，而產生主要分泌IL-17的Th17細胞[18]，再一次印證了上述結論。
綜上所述，隱球菌性腦膜炎患者外周血CD4+T細胞中IFN-γ表達與機體抵御隱球菌感染能力有關，但并不占主導作用，而TGF-β表達水平的上升伴隨著IL-9、IL-17的增加，對于增強機體對隱球菌殺傷作用、改善患者病情有著重要意義，值得進一步關注。
SCISSCIAHCI
