發(fā)布時間：2020-04-14所屬分類：醫(yī)學論文瀏覽：1次
摘 要： 硫酸軟骨素(chondroitinsulfate，CS)作為一種具有天然活性的酸性粘多糖類物質(zhì)，廣泛的存在于動物組織，尤其是軟骨和結締組織中。不同動物來源的Cs種類和數(shù)量各不相同造就了CS生物活性的多樣性，隨著對CS功能性質(zhì)的研究和應用的不斷深入，CS被廣泛的應用于保
硫酸軟骨素(chondroitinsulfate，CS)作為一種具有天然活性的酸性粘多糖類物質(zhì)，廣泛的存在于動物組織，尤其是軟骨和結締組織中。不同動物來源的Cs種類和數(shù)量各不相同造就了CS生物活性的多樣性，隨著對CS功能性質(zhì)的研究和應用的不斷深入，CS被廣泛的應用于保健食品、藥品和臨床中。目前，由于原料來源、生產(chǎn)工藝以及使用的測定方法不同，許多文獻報道的cs的產(chǎn)率和純度差別很大，使得cS的質(zhì)量很難控制，因此，CS的含量測定在檢驗生產(chǎn)工藝、產(chǎn)品進行質(zhì)量控制等方面的作用也越來越重要。本文對目前常見的CS含量測定方法進行梳理總結，以期為今后的科研和實際生產(chǎn)提供幫助。
1CS的結構特點
要想對CS的測定方法進行研究就必需對CS的結構特點有充分的了解。CS是EhD一葡萄糖醛酸(GlcA)和N一乙酰一D一氨基半乳糖(GalNAc)硫酸酯通過6—1，3糖苷鍵連接成為重復的二糖單位，二糖單位間通過B一1，4糖苷鍵聚合而成的一類大分子多糖。根據(jù)糖醛酸種類(葡萄糖醛酸GlcA/艾杜糖醛酸IdoA)以及氨基半乳糖上硫酸基取代位置(C一4/C一6)的不同，CS有許多同分異構體¨J
2CS含量測定方法的研究進展
CS的含量測定方法大致可以分為兩類，即直接測定和間接測定。直接測定不需對cS進行分解處理，不需要轉(zhuǎn)換，直接測定CS本身含量，因此直接測定方法能更準確的反應CS的實際含量;而間接測定不是測定cs本身而是將cs轉(zhuǎn)化成其他便于測定的物質(zhì)從而確定其含量。但由于CS分子上各種成分與其二糖單位間的相關性不一致，各種操作方法的可操作性、耗時和準確度等也不盡相同，因此在實際測定過程中要根據(jù)不同的方法進行選擇。
2.1直接測定方法
由于cs為聚陰離子，因此以CS中的陰性集團作為反應指示物的直接測定方法有陽離子染色法、CPC法、電化學法、色譜法等。
2.1.1陽離子染色法
帶正電的陽離子染料與CS的硫酸基和羧基生成復合物，導致染料本身的吸光度發(fā)生變化，根據(jù)反應前后吸光度的變化從而測定CS的含量。
陽離子染料的種類很多，使用不同的染料其具體測定方法也略有不同，適用范圍也不同。高貴珍等用天青A對CS進行染色，在625nm波長處測定了中藥復方制劑中CS的含量。由于天青A對不同的黏多糖選擇性不強，測定結果容易受其他黏多糖的影響。Pospichal等通過CS與天青B反應，用流動注射分析法以分光光度檢測器測定了cs含量，并分別在靜態(tài)及流動狀態(tài)下進行了研究j。施文健等用堿性艷藍BO對cs進行染色，在570nln波長處測定了Cs含量，這種方法簡便、快速、準確，但是對反應條件要求比較高，不易控制J。Li等將cs—A與結晶紫相互作用生成復合物，其RRS光譜比CS—A及結晶紫的RRS光譜明顯增強。其復合物在328nm波長處產(chǎn)生新的散射光譜，檢測了cS—A注射液及CS樣品中痕量的CS—A，此法適用于痕量的CS檢測，在實際測定中其使用范圍受到一定限制J。
陽離子染色法所用的染料不同，測定時所需的條件不同，染料和CS結合的特異性和緊密性也不同，因此這種方法雖然比較簡單、設備要求不高，但是受不同染料的影響其準確性也不一樣，需要根據(jù)實際測定的需要進行選擇。
2.1.2CPC法
CPC法是美國藥典規(guī)定的CS的含量檢測方法。美國藥典一處方集(USP—NF)CS含量測定法依據(jù)CS為聚陰離子，可與氯化十六烷基吡啶(CPC)作用生成難溶物，適宜條件下形成穩(wěn)定的混懸液，與已知濃度的CS溶液比較混懸液的透光度，可知檢測CS的含量。
姬勝利等報道了用CPC法在680nm處測定cs吸光度的變化從而測定CS的含量，不需要特殊的儀器，操作簡便。鐘明亮等報道了用光度滴定法測定Cosequin@DS咀嚼片中的CS—Na的方法，用0.1%(w/v)CPC滴定CS—Na并在420nm下用比色計指示光度變化，比色計顯示最大反應時即為終點，在選定的濃度范圍內(nèi)(0.6～1.4rag/mL)CS—Na標準曲線呈現(xiàn)良好的線性(r>10.99)，這種方法有針對性，良好的線性，準確度和精確度，非常適合原材料和Cosequin~DS咀嚼片中的cS—Na的定量測定，不需酶解酸解，直接測定，快速準確，4～5min/樣】。劉坤等報道了用CPC法快速測定Cs含量的方法，在波長680nm處測定CS在0～625g/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關系，r：0.998，方法回收率為98.49%，RSD為1.11%。該測定方法與氨基己糖法相比簡便快速，重現(xiàn)性好J。張關順報道了將cS對照品用水溶解，加入pH值7.2磷酸鹽緩沖溶液5mL，定容后用CPC滴定，以電位指示終點，求得校正因子，再用同法測樣品，計算含量。這種方法更簡便，不用空白，但對電壓的穩(wěn)定性要求較高。劉憲鋒等在報道膜技術在CS生產(chǎn)上的應用中使用CPC滴定儀測定cs含量，更為便捷…。
這種方法相對來說比較穩(wěn)定，結合儀器進行測定方便快捷，準確性也較高，目前已經(jīng)得到國內(nèi)外的認可。
2.1.3電化學法
Sun等用派洛寧B作電化學探針測定了CS含量。將cS加至派洛寧B溶液中，線性掃描伏安還原峰電勢無變化但電流明顯降低，電流降低與濃度呈線性關系。沈建如等利用高效毛細管電泳測定原料藥及片劑中cS含量，Cs在0.04—2.02g/mL的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系(r=0.9998)，平均回收率為100.2%，該法快速、簡單、準確，可用于原料藥及片劑中cS的含量測定¨。
電位法操作簡便快速，結果準確，穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，雜質(zhì)不干擾測定，實際操作中對測定條件如對電壓穩(wěn)定性要求高，在穩(wěn)壓穩(wěn)流的情況下可得到滿意結果。
2.1.4液相色譜法
趙振鋒等采用高效液相色譜法對cs進行直接分析，結果表明CS在1.742～8.71mg/mL濃度范圍內(nèi)同峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系(r=0.9998)，具有較好的重現(xiàn)性，此方法具有快速、準確、重復性好等優(yōu)點14]。潘自國等在209nm波長處測定了CS總量，不但能直接測定CS的總量，同時還能測定了A、B、C、D等4種異構體的含量¨。
液相色譜法快速、準確、重現(xiàn)性好，解決了蔗糖等還原糖對含量測定的干擾，但其基線噪音高，不穩(wěn)定，儀器平衡時間長，常有色譜峰拖尾，結果變異大，難以控制，而且CS相對分子量范圍較廣，不易選擇合適的對照品。對儀器和試劑要求高，一些色譜方法需要專業(yè)的軟骨素酶，價格昂貴，操作繁瑣;有些需要有毒試劑，造成操作的不便，在實際生產(chǎn)中應根據(jù)需要進行選擇。
2.2間接測定方法
間接測定方法是從CS的分子結構人手，將CS轉(zhuǎn)化分解為便于測定的結構單元進行測定，常用于測定的結構單元主要有：氨基己糖、葡萄糖醛酸、二糖單元和硫酸根等。
2.2.1氨基己糖
最早的關于CS測定的方法就是Elson—Morgan，目前我國藥品標準采用Elson—Morgan法測定cs含量，根據(jù)CS水解所得氨基葡萄糖與乙酰丙酮發(fā)生縮合反應，其產(chǎn)物與對二甲氨基苯甲醛的酸醇溶液呈紅色，測定525nm波長處吸光度。該方法操作繁瑣，重現(xiàn)性差，謝繼青等通過析因?qū)嶒灧治稣J為影響測定的主要因素是乙酰化和顯色，對該方法進行了優(yōu)化，增加了測定的精密度和重現(xiàn)性。李萍等對測定的時間條件進行了研究，分析時間比原方法縮短一半以上。
2.2.2葡萄糖醛酸
cs在酸性條件生成糠醛或其衍生物，與問苯三酚試劑反應，產(chǎn)物在554nm波長處有最大吸收。高華等用問苯三酚分光光度法對CS的測定進行了研究，在0.1～1.0mg/mL范圍內(nèi)線性關系良好(r=0.993)，具有良好的重現(xiàn)性。張華瑤等進行了操作條件的優(yōu)化，并測定了角膜寧滴眼液中cs含量。cs中的葡糖醛酸在硫酸的作用下生成糠醛，在咔唑的醇溶液中顯紅色，在520nm波長處有最大吸收。該法較測定氨基葡糖法簡單一些，但由于在操作過程中有濃硫酸，所以給實際操作帶來諸多不便。翟詠紅等用該法測定了真靈活膠囊(復方制劑)中CS的含量，制劑中的氨基葡萄糖對CS測定無干擾。4一氨基一3一肼基一5一巰基一1，2，4一三唑(AH.MT)作為顯色劑，與己糖醛酸或CS顯色靈敏。AH.MT在堿性溶液中與CS生成紫色衍生物，在540nm波長處測定吸光度可測定cs的含量J。劉坤等利用該法測定了軟骨魚類中CS的含量，并優(yōu)化了測定條件。
2.2.3二糖單元
軟骨素二糖的含量通常可采用高效液相色譜法、酶解一高效液相色譜法、反相離子對高效液相色譜法和反相高效液相色譜法測定。HitoshiOkamoto等報道了將CS用酶水解成為硫酸軟骨二糖，然后用毛細管酶反應測定其含量從而建立在線分析系統(tǒng)。在這個系統(tǒng)內(nèi)使用電泳遷移將酶混合物和底物Cs混合，然后在一個微弱的電場里面繼續(xù)進行反應，最后在外加電場的作用下反應的產(chǎn)物遷移到檢測器。為了減少蛋白質(zhì)的吸附，使用一個聚氯乙烯酒精涂抹的毛細管。在反極性作用下，二糖成功的遷移到10mMTris—acetatebuffer(pH值7.0)的陽極，在232nm下檢測。這種方法應用于滴眼液的檢測，不受輔料的干擾。線性良好(r≥0.999)，回收率100.0%～100.5%，精確度0.2%～0.6%(相對標準偏差)。精密、操作簡便、安全、快速、自動化，酶用量比HPLCCE少。
2.2.4硫酸根
茅力等用離子色譜法將Cs水解成等摩爾的硫酸根。用離子色譜柱將硫酸根和其他雜質(zhì)分離后以電導檢測器檢測。測定了CS原料、注射液和鯊魚軟骨粉中cs含量_2。后來他們又用原子吸收光譜法將鯊魚軟骨粉水解后，加入已知量的鋇離子使硫酸根沉淀。將樣品用水浸泡后做浸泡對照。用原子吸收光譜法測得游離硫酸根，從而算出水解出的有機硫酸根的量，再換算出CS含量J。
以上這幾種方法都是以cS的結構單元的一部分作為測定的基準物質(zhì)，原理上相同，一般先將CS進行水解，徹底分解為單體，然后再進行衍生化顯色反應。對儀器要求不高，準確度較高。但操作繁瑣、費時，干擾因素多，重復性差，一些衍生物往往還具有一定的毒性，目前在這方面的研究主要是對測定條件進行優(yōu)化，以達到提高準確性，簡便性，縮短反應時間。
3結論
從以上對各種方法的總結我們可以發(fā)現(xiàn)，不同方法有其自身的優(yōu)缺點，在實際測定中應該根據(jù)實際條件和對結果的要求不同選擇不同的方法。不同來源，不同生產(chǎn)工藝的CS在含量和結構方面都不相同，而目前文獻報道的CS的產(chǎn)率和純度差別很大，隨著全球市場CS需求量的增大，CS在保健品和臨床中的應用越來越廣泛，不同的產(chǎn)品CS含量也有差別，也需要對產(chǎn)品進行含量鑒定，所以CS含量測定方法不論在生產(chǎn)過程還是產(chǎn)品的質(zhì)量控制過程中的作用也越來越重要。因此研究簡便、便宜、快速、精確、安全、穩(wěn)定、重復性好的方法依然是未來發(fā)展的去勢。
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