發(fā)布時(shí)間：2020-01-15所屬分類：醫(yī)學(xué)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要:目的利用日落黃與牛乳中蛋白質(zhì)的吸附特性，探索牛乳中蛋白質(zhì)的快速檢測(cè)方法。方法利用比色法，探討了離心條件、檢測(cè)試劑體積、檢測(cè)試劑濃度、反應(yīng)時(shí)間、檢測(cè)試劑酸度以及三聚氰胺、尿素等非蛋白氮對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，在優(yōu)化好的條件下進(jìn)行了實(shí)際樣品的測(cè)
摘要:目的利用日落黃與牛乳中蛋白質(zhì)的吸附特性，探索牛乳中蛋白質(zhì)的快速檢測(cè)方法。方法利用比色法，探討了離心條件、檢測(cè)試劑體積、檢測(cè)試劑濃度、反應(yīng)時(shí)間、檢測(cè)試劑酸度以及三聚氰胺、尿素等非蛋白氮對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，在優(yōu)化好的條件下進(jìn)行了實(shí)際樣品的測(cè)定。結(jié)果1ml牛乳樣品，10ml檢測(cè)試劑，0.05%日落黃，反應(yīng)時(shí)間1min，13000r/min離心20min可獲得較好的檢測(cè)結(jié)果，方法的相對(duì)偏差為0.86%。在1.0%～5.0%范圍內(nèi)，方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=580x2-53.271x-0.2191。建立的方法用于牛乳樣品中蛋白質(zhì)的測(cè)定，結(jié)果與國(guó)標(biāo)一致。結(jié)論本文建立的方法可用于牛乳中蛋白質(zhì)的快速測(cè)定和非蛋白氮的快速篩查，有較好的應(yīng)用前景。
關(guān)鍵詞:牛乳;蛋白質(zhì);快速;試劑盒
近年來(lái)隨著我國(guó)乳制品市場(chǎng)的快速發(fā)展，牛乳的質(zhì)量安全越來(lái)越引起消費(fèi)者的廣泛關(guān)注。蛋白質(zhì)的含量是衡量牛乳營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高低的重要指標(biāo)之一。GB5009.5-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》是測(cè)定食品中蛋白質(zhì)含量的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法〔1〕，其中第一法凱氏定氮法和第二法分光光度法測(cè)定前均需將樣品中的蛋白質(zhì)在催化加熱條件下分解，通過(guò)測(cè)定處理后生成的氨、間接獲得蛋白質(zhì)的含量。以上方法存在的不足是不能有效區(qū)分蛋白氮和非蛋白氮〔2〕，因此不能檢測(cè)出三聚氰胺等非蛋白氮的非法添加。同時(shí)由于樣品前處理過(guò)程復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)，國(guó)標(biāo)方法尚不適于牛乳樣品中蛋白質(zhì)含量的快速測(cè)定〔3-5〕。本研究利用日落黃與牛乳中蛋白質(zhì)的吸附特性，在樣品不需要加熱分解處理的情況下，通過(guò)結(jié)合前后溶液顏色的變化實(shí)現(xiàn)牛乳中蛋白質(zhì)含量的快速檢測(cè)。相關(guān)研究對(duì)于實(shí)現(xiàn)牛乳中非蛋白氮的快速篩查和牛乳質(zhì)量監(jiān)測(cè)都具有重要意義。
1材料與方法
1.1主要儀器紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，臺(tái)式高速離心機(jī)TGL-16C，數(shù)顯型圓周振蕩器，紅外消化儀，凱氏定氮儀，磁力加熱攪拌器。
1.2主要試劑蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液購(gòu)于國(guó)家標(biāo)物中心，日落黃購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，生鮮乳取自天津市某奶牛養(yǎng)殖廠，市售牛奶購(gòu)于天津市某超市，超純水由Millipore公司純水機(jī)制得。
1.3方法原理酸性條件下日落黃溶液與牛奶中蛋白質(zhì)絡(luò)合并變性沉淀，溶液中日落黃濃度下降，利用絡(luò)合前后日落黃溶液濃度變化確定牛奶樣品中蛋白質(zhì)的含量。
1.4檢測(cè)試劑的配制0.1%檢測(cè)試劑儲(chǔ)備溶液配制:準(zhǔn)確稱取0.2874g日落黃，純水定容至250ml，搖勻。使用時(shí)用0.5mol/L的H2SO4稀釋至所需濃度。
1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線分別取1ml濃度為0、1%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、5%的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液與10ml濃度為0.05%的日落黃溶液混合，13000r/min離心20min后取上清液，稀釋10倍后以1ml純水樣品作對(duì)照，于483nm處測(cè)定吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.6樣品測(cè)定取牛乳1ml加10ml濃度為0.05%檢測(cè)試劑，13000r/min離心20min后取上清液，稀釋10倍后以1ml純水樣品作對(duì)照，于483nm處測(cè)定吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算牛乳中蛋白質(zhì)的含量。
2結(jié)果與討論
2.1離心時(shí)間和離心機(jī)轉(zhuǎn)速的影響檢測(cè)試劑與牛乳樣品混合后，一方面日落黃與牛乳蛋白絡(luò)合，另一方面絡(luò)合后的蛋白在酸性條件下變性，因此在一定的轉(zhuǎn)速條件下需確定合適的離心條件使蛋白完全沉淀。在13000r/min條件下，將10ml濃度為0.001%檢測(cè)試劑與1ml牛乳渦旋混合1min后，取上清液于483nm處以純水為參比測(cè)定吸光度。結(jié)果表明:對(duì)于10ml的檢測(cè)試劑，13000r/min條件下離心20min后上清液吸光度基本穩(wěn)定。
2.2檢測(cè)試劑濃度的影響檢測(cè)試劑中日落黃的濃度對(duì)于牛乳中蛋白的吸附效果有關(guān)鍵性的作用，在離心時(shí)間20min、離心轉(zhuǎn)速13000r/min、檢測(cè)試劑體積10ml的優(yōu)化條件下，選取濃度分別為0.0005%、0.001%、0.0025%、0.005%、0.01%、0.02%、0.04%、0.05%和0.1%的日落黃10ml，分別與1ml的牛乳混合渦旋1min離心后，取上清液稀釋10倍，于483nm測(cè)定吸光度;對(duì)照樣品為1ml純水，試驗(yàn)方法同上。以相同濃度檢測(cè)試劑對(duì)照樣品與牛奶樣品檢測(cè)吸光度的差值為縱坐標(biāo)，以日落黃濃度為橫坐標(biāo)，結(jié)果如圖1所示。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)濃度為0.0005%～0.01%的檢測(cè)試劑在離心后上層均有懸浮物，可能是由于檢測(cè)試劑的濃度過(guò)低時(shí)不能完全將牛乳中的蛋白完全吸附。從圖1可以看出，隨著檢測(cè)試劑中日落黃濃度的增大，與牛乳反應(yīng)前后體系吸光度的差值也不斷增大，0.05%的檢測(cè)試劑與樣品混合后的反應(yīng)前后吸光度差值達(dá)到最大，顯色劑濃度繼續(xù)增加時(shí)差值反而下降，因此實(shí)驗(yàn)下一步選擇檢測(cè)試劑中日落黃的濃度為0.05%。
2.3絡(luò)合時(shí)間的影響檢測(cè)試劑中的日落黃與牛奶樣品的蛋白吸附需要一定的反應(yīng)時(shí)間，在上述優(yōu)化好的實(shí)驗(yàn)條件下，分別選擇1、2、3、5、8、10min的反應(yīng)時(shí)間，其余操作同上，測(cè)得結(jié)果如圖2所示。由圖中可以看出，日落黃與牛奶中蛋白的絡(luò)合時(shí)間很短，反應(yīng)1min以后吸光度基本趨于穩(wěn)定，考慮到快速檢測(cè)應(yīng)盡量在較短的時(shí)間內(nèi)完成，因此將混合時(shí)間確定為1min。
2.4酸度的影響檢測(cè)試劑的酸度直接關(guān)系到牛乳中蛋白是否完全變性沉淀，只有保證牛乳中的蛋白被完全沉淀，測(cè)得的結(jié)果才會(huì)準(zhǔn)確。實(shí)驗(yàn)選取0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.4、0.5和1.0mol/L的硫酸作為日落黃的稀釋溶液，按照1.6方法進(jìn)行測(cè)定。以檢測(cè)試劑酸度作為橫坐標(biāo)，吸光度與對(duì)照樣品吸光度的差值作為縱坐標(biāo)，結(jié)果如圖3所示。在實(shí)驗(yàn)中可以觀察到0.05～0.4mol/L酸度的檢測(cè)試劑在離心后上層均出現(xiàn)不同程度的懸浮物，由于酸度較低使得蛋白凝固的顆粒較小，在離心過(guò)程中未能離心下去，而1.0mol/L酸度的檢測(cè)試劑的靈敏度與0.5mol/L相比差別不大，故實(shí)驗(yàn)選擇酸度為0.5mol/L的檢測(cè)試劑。
2.5溫度的影響考慮到現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)有可能涉及室外不同的溫度，實(shí)驗(yàn)選取20、25、30、35、40℃等幾個(gè)溫度，考察了反應(yīng)溫度對(duì)檢測(cè)體系的影響，結(jié)果如圖4所示。分析結(jié)果可知，溫度對(duì)檢測(cè)體系的影響很小，40℃時(shí)吸光度略有增大，但考慮到實(shí)際情況，一般氣溫不會(huì)達(dá)到40℃，故認(rèn)為溫度對(duì)該實(shí)驗(yàn)的影響基本可以忽略不計(jì)。
3方法性能
3.1干擾情況在優(yōu)化好的試驗(yàn)條件下，試驗(yàn)選擇幾種非蛋白氮，以驗(yàn)證方法的抗干擾性能和在實(shí)際應(yīng)用中鑒別非法添加的能力。實(shí)驗(yàn)分別考察了1.0g/L的尿素、三聚氰胺、甘氨酸對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，結(jié)果表明，在1.0g/L的濃度條件下三種干擾物對(duì)檢測(cè)體系顯色無(wú)干擾，說(shuō)明非蛋白氮不會(huì)影響本方法的檢測(cè)結(jié)果。
3.2方法精密度取1ml牛乳樣品與0.05%、10ml顯色劑混合1min、13000r/min離心20min后取上清液稀釋10倍后，于483nm處以空白管為參比，測(cè)定吸光度，方法的相對(duì)偏差為0.86%。
3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線在優(yōu)化的最佳條件下，分別取1ml濃度為1.0%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、5.0%的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.6方法測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=580x2-53.271x-0.2191，R2=0.9977，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示。
3.4樣品測(cè)定分別選取了1種生鮮乳樣品和2種市售牛乳樣品，采用本法與GB5009.5-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》的第一法凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表1所示。由表1可知，本法與國(guó)標(biāo)方法的測(cè)定結(jié)果基本一致，表明本方法適用于牛乳中蛋白質(zhì)的測(cè)定。
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4結(jié)論
本研究利用日落黃與牛乳中蛋白質(zhì)的吸附特性，通過(guò)結(jié)合前后溶液顏色的變化實(shí)現(xiàn)牛乳中蛋白質(zhì)含量的快速檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)對(duì)離心條件、檢測(cè)試劑體積、檢測(cè)試劑濃度、混合時(shí)間、檢測(cè)試劑酸度等條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明在離心20min、離心速度13000r/min、檢測(cè)試劑10ml、檢測(cè)試劑濃度0.05mol/ml、混合1min、試劑酸度為0.5mol/ml時(shí)，獲得了較好的檢測(cè)結(jié)果。方法與國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)結(jié)果基本一致，可用于牛乳樣品中蛋白質(zhì)和非蛋白氮的快速檢測(cè)篩查。
