發(fā)布時(shí)間：2020-01-17所屬分類：醫(yī)學(xué)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要: 目的 經(jīng)正交設(shè)計(jì)的雷公藤多糖提取純化實(shí)驗(yàn)，選出最佳雷公藤多糖提取純化的工藝。方法 雷公藤葉和根經(jīng)粉碎后用無(wú)水乙醇潤(rùn)濕，封口過夜，揮干藥材; 用石油醚 60 ～ 90℃ 回流提取 1h，重復(fù)實(shí)驗(yàn) 1 次，揮干藥材; 用 95% 乙醇回流提取 1h，重復(fù)實(shí)驗(yàn) 2 次，
摘要: 目的 經(jīng)正交設(shè)計(jì)的雷公藤多糖提取純化實(shí)驗(yàn)，選出最佳雷公藤多糖提取純化的工藝。方法 雷公藤葉和根經(jīng)粉碎后用無(wú)水乙醇潤(rùn)濕，封口過夜，揮干藥材; 用石油醚 60 ～ 90℃ 回流提取 1h，重復(fù)實(shí)驗(yàn) 1 次，揮干藥材; 用 95% 乙醇回流提取 1h，重復(fù)實(shí)驗(yàn) 2 次，揮干藥材; 用去離子水水煮 1h，重復(fù)實(shí)驗(yàn) 2 次，濃縮水提取液到與藥材重量相等。濃縮水提取液經(jīng)乙醇醇沉，抽濾得到沉淀物經(jīng)過氧化氫脫色后，以不同水提取液與乙醇的比例、氯仿與正丁醇體積比、脫色液與 Sevage 試劑( 氯仿: 正丁醇) 體積比、脫蛋白時(shí)間、除蛋白次數(shù)進(jìn)行 4 因素 3 水平正交實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 雷公藤多糖提取純化最佳工藝條件為水提取液與乙醇的比例為 80% ，氯仿與正丁醇為 4 ∶ 1，脫色液與 Sevage 試劑為 3∶ 1，次數(shù)為 2 次，雷公藤多糖的脫蛋白率為 78. 5% ，多糖損失率為 33. 3% 。結(jié)論 經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)選出最佳雷公藤多糖提取純化的工藝條件科學(xué)合理、穩(wěn)定可行，為純化雷公藤多糖提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
關(guān)鍵詞: 雷公藤; 多糖; 提取純化; 單因素實(shí)驗(yàn); 正交實(shí)驗(yàn)
雷公藤為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，又名黃藤根、菜蟲藥等[1]，味苦、辛，性涼。通過研究發(fā)現(xiàn)其藥理作用有免疫調(diào)節(jié)、抗炎及抗腫瘤等作用[2]。對(duì)雷公藤深入研究，其臨床應(yīng)用也取得了很大的進(jìn)展，例如用雷公藤治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、白塞病; 治療多種腎病取得較佳效果[3]，另外雷公藤還能有效治療子宮肌瘤、Graves 眼病和多種皮膚病[4 ～ 7]。雷公藤成分復(fù)雜，至今國(guó)內(nèi)外學(xué)者已從雷公藤屬植物分析出近 70 種成分，主要為生物堿類、二萜類、三萜類、倍半萜類及多糖類[8]。但對(duì)于雷公藤這些化學(xué)成分的研究目前也主要集中在生物堿類、二萜類、三萜類、倍半萜類[9，10]。中藥治療糖尿病具有療效穩(wěn)定、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)[11]，雷公藤的降血糖作用雖為人們所知，但其具體的降血糖的有效部位是什么目前尚未見有關(guān)報(bào)道。我們?cè)谇捌诠ぷ髦型ㄟ^活性示蹤法發(fā)現(xiàn)雷公藤降血糖的有效部位是它的多糖成分，因此，本課題擬采用正交實(shí)驗(yàn)法獲得雷公藤粗多糖，選出最佳的實(shí)驗(yàn)條件，為開發(fā)雷公藤成為新的治療糖尿病的藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。多糖的提取方法有溶劑提取法、酸提取法等[12]; 除蛋白的方法有 Sevage 法、三氯乙酸法等[13]。雷公藤多糖的提取與含量測(cè)定已被梁惠花，劉曉河等人進(jìn)行了研究[14]，為雷公藤的提取、測(cè)定奠定了基礎(chǔ)，沈萃，謝三都，徐芳等人對(duì)紫蘇葉多糖進(jìn)行了純化工藝正交實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)[15]，其中的正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)為雷公藤的純化理論依據(jù)。因此，本課題擬先對(duì)單因素進(jìn)行優(yōu)化，然后運(yùn)用正交實(shí)驗(yàn)的方法對(duì)相關(guān)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，為純化雷公藤多糖提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1 材料與儀器
1. 1 材料 本實(shí)驗(yàn)研究的雷公藤采摘于廣西，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)蔡毅教授鑒定為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，提取雷公藤多糖部位是打碎的根和葉。
1. 2 試劑 無(wú)水碳酸鈉、氫氧化鈉等均為分析純 AR、500g( 成都市科龍化工試劑廠) ; 30% 過氧化氫、石油醚 60 - 90℃、三氯甲烷、正丁醇、無(wú)水乙醇均為分析純( 成都市科龍化工試劑廠) ; 四水酒石酸鉀鈉( 廣東光華科技股份有限公司) ; 苯酚( 廣東光華科技股份有限公司) ; 葡萄糖 - 水( 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司) ; 硫酸銅( 硫酸銅天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司) ; 牛血清白蛋白 V5g A8020 - 5( 北京索萊寶科技有限公司) ; 福林酚 F8060 - 500( 北京索萊寶科技有限公司) 。
1. 3 儀器 UV -1780 紫外可見分光光度計(jì)[島津儀器( 蘇州) 有限公司]; SH - B95 循環(huán)水式多用真空泵( 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司) ; HWS -12 電熱恒溫水浴鍋( 上海齊欣科技儀器有限公司) ; BSA224S 電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器( 北京) 有限公司]; ST16R 高速冷凍離心機(jī)[賽默飛世爾科技( 中國(guó)) 有限公司]; UPK - 11 - 20L 優(yōu)普系列超純水器( 四川優(yōu)普超純水科技有限公司) ; DHG - 9203A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱( 上海齊欣科技儀器有限公司) ; 715 玻璃比色皿( 宜興市中科工業(yè)玻璃有限公司) ; DF -101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器( 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司) ; GH21 微電腦數(shù)碼遠(yuǎn)紅外爐( 深圳市鑫富達(dá)機(jī)電有限公司) 。
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2 方法與結(jié)果
2. 1 雷公藤多糖的提取流程 雷公藤根和葉→粉碎→提取→雷公藤多糖水提取溶液。
2. 2 雷公藤多糖損失率的測(cè)定 將葡萄糖 - 水標(biāo)準(zhǔn)樣為基準(zhǔn)，參照苯酚 - 硫酸法[16]測(cè)定雷公藤多糖含量。用葡萄糖 - 水標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的測(cè)定方法，測(cè)定雷公藤多糖提取液脫蛋白前后多糖含量，并參照公式[15]計(jì)算雷公藤多糖損失率:
雷公藤多糖損失率( % ) = [( M0 - M1 ) /M0]× 100 % 式中: M0 表示脫蛋白前雷公藤多糖質(zhì)量( mg) ; M1 表示脫蛋白后雷公藤多糖質(zhì)量( mg) 。 2. 3 雷公藤多糖脫蛋白率的測(cè)定 參 考 2015 年 版《中 國(guó) 藥典》[17]，對(duì)照液的制備，除另有規(guī)定外，去血清白蛋白( 牛) 對(duì)照品或蛋白質(zhì)含量測(cè)定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，加去離子水溶解，制成 0. 2mg ·ml - 1 的溶液。
測(cè)定法: 精密量取對(duì)照品溶液 0. 0 ml，0. 2 ml，0. 4 ml，0. 6 ml，0. 8 ml，1. 0 ml，分別置試管中，各加水至 1. 0 ml，再分別加入堿性銅試液 5. 0 ml，搖勻室溫放置 10min，各加入福林酚試液 0. 5 ml 立即混勻，室溫放置 30min，紫外 - 可見分光光度計(jì)( UV - 1780) 在 650 nm 的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[17，18]。
將經(jīng)提取得雷公藤多糖提取液經(jīng)醇沉后脫色，脫色后的溶液再進(jìn)行 Sevage 試劑法脫蛋白。參照文獻(xiàn)[17] 中蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法，并參照公式[15]計(jì)算雷公藤多糖損失率:
雷公藤多糖脫蛋白率( % ) = [( G0 - G1 ) /G0]× 100% 式中: G0 表示脫蛋白前雷公藤質(zhì)量( mg) ; G1 表示脫蛋白后雷公藤多糖的蛋白質(zhì)質(zhì)量( mg) 。
2. 4 雷公藤多糖脫蛋白工藝的單因素實(shí)驗(yàn) 將雷公藤多糖脫蛋白率和雷公藤多糖損失率為測(cè)定指標(biāo)，以水提取液與乙醇的比例，Sevage 試劑法進(jìn)行雷公藤多糖脫蛋白的單因素實(shí)驗(yàn)。
2. 4. 1 水提取液與乙醇的比例 添加無(wú)水乙醇到水提取液中，乙醇體積分?jǐn)?shù)為 60% ，醇沉后溶液分有上下兩層，抽濾后，加同等水提取液體積去離子水溶解，并加入加 30% 過氧化氫使含量到達(dá) 5% ，暴曬去過氧化氫后，測(cè)定雷公藤多糖脫蛋白率和多糖損失率，同法測(cè)定體積分?jǐn)?shù)為 70% 、80% 、90%[19]。
2. 4. 2 氯仿與正丁醇體積比 振蕩時(shí)間 30 min，雷公藤多糖脫色液與 Sevage 試劑體積比為 1∶ 1 ，3000 r·min - 1 離心 5 min，取水層，有機(jī)層有機(jī)層重復(fù)脫蛋白 1 次[15]，合并水層，測(cè)定雷公藤多糖脫蛋白率和多糖損失率，氯仿與正丁醇體積比分別為 2∶ 1，3 ∶ 1，4∶ 1 和 5∶ 1 同法測(cè)定。
2. 4. 3 脫色液與 Sevage 試劑體積比 氯仿∶ 正丁醇 = 3∶ 1，振蕩時(shí)間 30 min，脫色液與 Sevage 試劑體積比為 1 ∶ 1，3000 r· min - 1 離心 5 min，取水層，有機(jī)層重復(fù)脫蛋白 1 次[15]，合并水層，測(cè)定雷公藤多糖脫蛋白率和多糖損失率，脫色液與 Sevage 試劑體積比為 2∶ 1，3∶ 1，4∶ 1 同法測(cè)定。
2. 4. 4 除蛋白次數(shù) 振搖時(shí)間 30 min，雷公藤多糖脫色液與 Sevage 試劑體積比為 2∶ 1，氯仿: 正丁醇 = 3∶ 1，3000 r·min - 1 離心 5 min，取水層[15]，有機(jī)層重復(fù)脫蛋白 1 ，2，3，4 次，合并水層，測(cè)定雷公藤多糖脫蛋白率和多糖損失率。
2. 5 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化雷公藤多糖脫蛋白工藝 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將雷公藤多糖脫蛋白率和雷公藤多糖損失率作為指標(biāo)，選取 L9 ( 34 ) 正交表對(duì)不同水提取液與乙醇的比例( A) 、氯仿與正丁醇體積比( B) 、脫色液與 Sevage 試劑體積比( C) 、除蛋白次數(shù) ( D) 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定雷公藤多糖脫蛋白的最佳工藝條件。正交因素水平見表 1。
由圖 1 可知，經(jīng)苯酚 - 硫酸法測(cè)定葡萄糖 - 水，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為 Y = 10. 2965X + 0. 00784200，Y 表示在 487. 5 nm 波長(zhǎng)處的吸光度 OD 值; X 表 示 葡 萄 糖 - 水 溶 液 濃 度 mg · ml - 1 ，R2 = 0. 99683，在 0 ～ 0. 06 mg·ml - 1 葡萄糖 - 水溶液濃度與吸光度的關(guān)系。
2. 6. 2 福林酚法測(cè)定蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線 見表 3，圖 2。
由圖 2 可知，經(jīng)福林酚法測(cè)定蛋白質(zhì)，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線 Y = 2. 43498X + 0. 048954，Y 表示在 650 nm 波長(zhǎng)處的吸光度 OD 值 ; X 表示牛血清白蛋白溶液濃度 mg·ml - 1 ，R2 = 0. 99898，在 0 ～ 0. 2 mg·ml - 1 牛血清白蛋白溶液濃度與吸光度的關(guān)系。
2. 6. 3 水提取液與乙醇的比例對(duì)雷公藤多糖脫蛋白效果的影響見圖 3。
從圖 3 可知，雷公藤多糖脫蛋白率隨乙醇的含量增加，先減小后增大再減小。當(dāng)水提取液與乙醇的比例為 60% 時(shí)，脫蛋白率為 87. 2% ; 繼續(xù)增加乙醇的含量，脫蛋白率下降。當(dāng)水提取液與乙醇的比例為 90% ，脫蛋白率為 71. 8% ，多糖的損失率為 21% 。
2. 6. 4 氯仿與正丁醇體積比對(duì)雷公藤多糖脫蛋白效果的影響見圖 4。
由圖 4 可知，氯仿與正丁醇體積比增加，雷公藤多糖的脫蛋白率呈上升的趨勢(shì)。當(dāng)氯仿∶ 正丁醇比例 = 5∶ 1 時(shí)，脫蛋白率最高為 89% ; 對(duì)于雷公藤多糖損失率，隨氯仿與正丁醇體積比增加，它的趨勢(shì)為先上升后下降再上升。當(dāng)氯仿: 正丁醇: 比例 = 4 ∶ 1 時(shí)，多糖損失率最低為 39. 2% 。
2. 6. 5 脫色液與 Sevage 試劑體積比對(duì)雷公藤多糖脫白效果的影響 見圖 5。
從圖 5 中可以看出，雷公藤多糖的脫蛋白率和多糖損失率沒有一定的規(guī)律，當(dāng)脫色液; Sevage 試劑 = 2∶ 1 時(shí)，雷公藤多糖脫蛋白率最高為 84. 5% ，多糖的損失率為 37. 3% ，都高于其他比例。當(dāng)脫色液: Sevage 試劑 = 1 ∶ 1 時(shí)，雷公藤多糖脫蛋白率為 76. 8% ，多糖損失率為最低 15. 7% 。
2. 6. 6 除蛋白次數(shù)對(duì)雷公藤多糖脫蛋白效果的影響 見圖 6。
從圖 6 中可以看出，雷公藤多糖脫色液的脫蛋白率和多糖損失率隨除蛋白次數(shù)增加呈上升趨勢(shì)。
2. 6. 7 雷公藤多糖脫蛋白工藝的正交實(shí)驗(yàn) 雷公藤多糖脫蛋白正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表 4 所示。
K1，K2，K3 表示脫蛋白率的總和，Κ1，Κ2，Κ3 表示脫蛋白率的平均值; K4，K5，K6 表示多糖損失率的總和，Κ4，Κ5，Κ6 表示多糖損失率平均值; R 值表示脫蛋白、多糖損失率的極差。其中如 K1 的 237. 8、228. 2、234. 2、235. 1 分別表示 A 水提取液與乙醇的比例( 70% ) 、B 氯仿: 正丁醇( 3 ∶ 1) 、C 脫色液: Sevage 試劑( 1 ∶ 1) 、D 脫蛋白次數(shù)( 2 次) 脫蛋白總和，依次類推。
由 k 值得比較可知，選擇 A1，B1，C1，D1 為水提取液與乙醇的比例、Sevage 試劑法對(duì)雷公藤脫蛋白率的最優(yōu)工藝條件，經(jīng)測(cè)定雷公藤脫蛋白率為 82. 4% ; 而對(duì)于雷公藤多糖損失率選擇 A3， B3，C2，D1 為雷公藤多糖損失率最少的工藝條件，測(cè)定雷公藤多糖損失率為 29. 3% 。
3 討論
根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的條件考慮，提取雷公藤多糖采用水提醇沉法，此法是提取多糖最常用的一種方法，多糖是極性大分子化合物，提取時(shí)一般選擇水、醇等極性強(qiáng)的溶劑[20]。在后期實(shí)驗(yàn)中我們就溶劑浸提法、酶法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、超臨界流體萃取法進(jìn)行了對(duì)比[12]。大量的相關(guān)資料中表明，對(duì)比出各類方法的優(yōu)缺點(diǎn)。溶劑浸提法是實(shí)際工作中應(yīng)用最普遍的方法，但多糖損失率也較大; 酶解法，條件較為溫和雜質(zhì)易除、得率高; 超聲輔助提取法節(jié)約時(shí)間，提取的有效成分高; 微波輔助提取法萃取時(shí)間短，效率高; 超臨界流體萃取法萃取效率高、速度快。
對(duì)于做正交實(shí)驗(yàn)因素可以進(jìn)一步探索，比如說，脫蛋白的時(shí)間、脫蛋白的溫度等; 在摸索實(shí)驗(yàn)條件過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)把醇沉放在實(shí)驗(yàn)的最后，抽濾出來的多糖帶有黏性，色素清除得不干凈; 同時(shí)也應(yīng)該也做活性炭對(duì)比除色素，對(duì)比在除色素時(shí)那個(gè)損失率的大小。
從圖 3 結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，雷公藤多糖脫蛋白率和損失率呈現(xiàn)的不是趨勢(shì)性的圖像，應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)減少誤差，或者是在 70% ～ 80% 水提取液與乙醇比例再設(shè) 75% 進(jìn)行測(cè)定，縮小測(cè)定范圍，增加準(zhǔn)確度。
在圖 4 中我們可以看到，雷公藤多糖脫蛋白率是呈上升的趨勢(shì)，那么對(duì)于多糖的損失率先上升后下降。由于實(shí)驗(yàn)所用的氯仿帶有毒，所以用氯仿的用量少，脫蛋白的效果要好，所以選了氯仿用少的作中間水平。在后期的細(xì)胞要使用到純化的多糖，那么減少氯仿的使用，可以將氯仿對(duì)細(xì)胞的毒害降到最低。脫蛋白的方法三氯乙酸法等[13]，在后期的后期實(shí)驗(yàn)中可以做此來對(duì)比，可以減少氯仿的使用，減少有毒物質(zhì)的使用。
在探索脫色液與 Sevage 試劑的比例對(duì)雷公藤多糖脫白效果的影響時(shí)可以發(fā)現(xiàn)雷公藤多糖脫蛋白率和損失率不成正比，那么則選用少的有機(jī)溶劑，起到最大脫蛋白率和最少多糖損失率。
另外，除蛋白次數(shù)的實(shí)驗(yàn)相當(dāng)于多次萃取的實(shí)驗(yàn)，理論上當(dāng)萃取的次數(shù)越多，所得的物質(zhì)的純度更大。在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)除蛋白次數(shù)增加時(shí)，用離心機(jī)多次脫蛋白的上層溶液不好吸取，容易將下層的蛋白質(zhì)吸到，所以除蛋白的次數(shù)并不是越多越好，要根據(jù)實(shí)際情況選擇除蛋白的次數(shù)。
對(duì)于雷公藤的脫蛋白來說，脫蛋白率越高越好而多糖損失率越低越好。單獨(dú)分析可知雷公藤多糖的脫蛋白率和多糖的損失率的最佳工藝條件并不一致。因此，根據(jù)極差分析影響因素的主次，確定最佳工藝條件。水提取液與乙醇的比例、Sevage 試劑法對(duì)雷公藤多糖的脫蛋白率來說，比較各列的極差結(jié)果 R 值后，發(fā)現(xiàn) RA > RD > RC > RB，即水提取液: 乙醇 > 脫蛋白次數(shù) > 脫色液: Sevage 試劑 > 氯仿: 正丁醇。那么對(duì)雷公藤多糖造成的損失而言，比較各列的極差結(jié)果 R 值，可以發(fā)現(xiàn) RA > RD > RB > RC，即水提取液: 乙醇 > 脫蛋白次數(shù) > 氯仿: 正丁醇 > 脫色液: Sevage 試劑。對(duì)于因素 A，即水提取液與乙醇的比例，發(fā)現(xiàn)雷公藤脫蛋白率和多糖損失率均位列第一，故可選用 A2 ; 對(duì)于因素 B，即氯仿: 正丁醇，對(duì)脫蛋白率最后和多糖損失率第三，此時(shí)應(yīng)取 B1 或者 B2，當(dāng)取 B1時(shí)，取 A2，B1，C2，D3 條件下雷公藤蛋白質(zhì)損失率為 74. 2% ，多糖損失率為 36% ，當(dāng)取 B2 時(shí)，雷公藤蛋白質(zhì)損失率增加了 4. 3% ，多糖損失率下降 2. 7% 。所以 B 因素取 B2。對(duì)于因素 C，即脫色液: Sevage 試劑，對(duì)雷公藤的蛋白質(zhì)損失率排第三而多糖損失率排最后，故取 C3 ; 對(duì)于因素 D，即除蛋白次數(shù)，可取 D1。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水提取液: 乙醇、氯仿: 正丁醇、脫色液: Sevage 試劑、除蛋白次數(shù)對(duì)雷公藤多糖脫蛋效果影響較顯著，選為正交實(shí)驗(yàn)研究的四個(gè)因素三水平實(shí)驗(yàn)對(duì)雷公藤多糖起到提取純化的作用。雷公藤多糖提取純化最佳工藝條件應(yīng)為 A2B2C3D1 即水提取液與乙醇的比例為 80% ，氯仿與正丁醇的體積比為 4 ∶ 1，脫色液與 Sevage 試劑的體積比為 3 ∶ 1，除蛋白次數(shù)為 2 次，雷公藤多糖的脫蛋白率為 78. 5 % ，多糖損失率為 33. 3% 。該工藝提取操作簡(jiǎn)單，純化效果良好，為后續(xù)研究提供了足夠的藥材來源，提取的雷公藤多糖經(jīng)后續(xù)實(shí)驗(yàn)初步證明能將胰島來源的胰腺干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞團(tuán) ( 相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果未發(fā)表) ，有望為解決臨床胰島移植治療糖尿病面臨的供體匱乏等困難提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
