發(fā)布時(shí)間：2019-12-14所屬分類：醫(yī)學(xué)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：在高中階段的生物學(xué)習(xí)中，了解到21世紀(jì)是生物技術(shù)大發(fā)展時(shí)期，各種技術(shù)革新紛紛涌現(xiàn)，本人對這一專業(yè)產(chǎn)生了興趣，因此于2018年7月暑假期間來到寧波酶賽生物工程有限公司學(xué)習(xí)相關(guān)知識。該公司擅長生物酶和菌種相關(guān)的專業(yè)催化技術(shù)，在制藥工程、精細(xì)化工
摘要：在高中階段的生物學(xué)習(xí)中，了解到21世紀(jì)是生物技術(shù)大發(fā)展時(shí)期，各種技術(shù)革新紛紛涌現(xiàn)，本人對這一專業(yè)產(chǎn)生了興趣，因此于2018年7月暑假期間來到寧波酶賽生物工程有限公司學(xué)習(xí)相關(guān)知識。該公司擅長生物酶和菌種相關(guān)的專業(yè)催化技術(shù)，在制藥工程、精細(xì)化工、新型材料、生物產(chǎn)業(yè)、節(jié)能環(huán)保產(chǎn)業(yè)等領(lǐng)域提供技術(shù)支持。由于時(shí)間有限，在學(xué)習(xí)過程中，我著重了解并參與了構(gòu)建定點(diǎn)突變單克隆的過程研究。
關(guān)鍵詞：生物學(xué)習(xí);定點(diǎn)突變單克隆
一、研究背景
單克隆技術(shù)當(dāng)下是國內(nèi)外的熱點(diǎn)研究課題，但國內(nèi)對于單克隆技術(shù)的研究仍存在一些問題，對單克隆領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)研究是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，還有待進(jìn)一步提高。單克隆與克隆技術(shù)是兩個(gè)不同的研究方向，區(qū)別在于克隆的定義更為廣泛，克隆原意以無性繁殖或營養(yǎng)繁殖的方式培育植物，隨后范圍擴(kuò)展至以無性繁殖的方式培育動物：眾所周知的典型代表為1996年的多利羊。雖然克隆有巨大的理論意義和實(shí)用價(jià)值，但它是一把雙刃劍，有優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)也存在危險(xiǎn)，它可能觸及人類倫理道德方面的底線，因此各國也出臺相關(guān)法律。而單克隆是指單一序列的質(zhì)粒在平板上長出的菌落，只是利用克隆的理論和原理，培育的對象是不同的，單克隆主要針對質(zhì)粒(如大腸桿菌等自身攜帶質(zhì)粒)，安全性因此更高，同樣不會有悖于人類倫理道德。
因此，設(shè)計(jì)這個(gè)課題目的旨在了解構(gòu)建定點(diǎn)突變單克隆的基本過程，對于并非定點(diǎn)的突變單克隆還并未嘗試。
二、理論及技術(shù)支持
以《分子生物學(xué)》和《細(xì)胞生物學(xué)》理論為基礎(chǔ)，生物信息學(xué)技術(shù)和PCR技術(shù)為指導(dǎo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。
三、研究過程
(一)研究目的
在完成單克隆制備的流程時(shí)，先運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)和PCR技術(shù)，使用計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)含有定點(diǎn)突變位點(diǎn)的引物在模板載體上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再與標(biāo)準(zhǔn)DNAmarker表對比，判斷其是否是假陽性，最終完成檢測篩選過程。
(二)準(zhǔn)備條件
1.實(shí)驗(yàn)器材(具備條件)：
12頭移液槍(2～20μl)，PCR儀，恒溫水浴鍋，掌上離心機(jī)，渦旋儀，2ml離心管，離心管架，刀片，凝膠，計(jì)算機(jī)，平板，紫外凝膠顯色儀，marker表
2.準(zhǔn)備工作
①帶實(shí)驗(yàn)手套
②載體的制備：選用合適的質(zhì)粒，選擇同一種限制性核酸內(nèi)切酶打開環(huán)狀結(jié)構(gòu)，便于后續(xù)過程中與連接產(chǎn)物連接。
③設(shè)計(jì)引物：引物最好選用DNA，因?yàn)镽NA在外界容易降解，所以在體外用DNA易操作，引物長度一般在15個(gè)堿基左右，在引物中加標(biāo)記基因，用計(jì)算機(jī)，輸入模板，設(shè)計(jì)多個(gè)突變位點(diǎn)。
④引物的稀釋：將其裝入離心管中，用離心機(jī)將其稀釋。注意要先離心后再開蓋加水，因?yàn)镈NA是干粉狀態(tài)，運(yùn)輸過程中有可能粘附在管蓋和管壁上，直接打開后可能會丟失部分。加水量為DNA合成報(bào)告單上的nmol數(shù)目*100。
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(三)實(shí)驗(yàn)步驟和過程
1.擴(kuò)增帶突變的小片段(用PCR)，并用一種混合型酶消化模板基因。
2.將小片段拼成大片段。
3.目的片段擴(kuò)增(PCR)：擴(kuò)增獲得含有突變位點(diǎn)的基因。
4.酶切：切出粘性末端，便于后期和載體連接。使用的限制性核酸內(nèi)切酶通常放置于冰箱中，因?yàn)槠漭^脆弱，使用時(shí)才將其取出。限制性核酸內(nèi)切酶具有特異性，切出目的基因和切開環(huán)狀載體時(shí)應(yīng)該選擇同一種限制性核酸內(nèi)切酶，使其產(chǎn)生相同的粘性末端以連接。
5.切膠回收：用刀片在紫外凝膠顯色儀中操作。提純酶切的基因。切完情況如圖，用切膠回收試劑盒提取待用。在紫外燈下切膠回收時(shí)，要襯以干凈的塑料薄膜，使用無DNA污染的新刀片，防止出現(xiàn)外源DNA的污染。
6.連接：使用DNA連接酶，將載體通過特定的內(nèi)切酶切出與產(chǎn)物相同的粘性末端。
7.轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，利用熱量，類似質(zhì)壁分離原理，制造出一些微小的“孔”讓DNA進(jìn)入。
8.涂平板：檢測篩選，原理如下：之前擴(kuò)增DNA的時(shí)候就已經(jīng)帶有了標(biāo)記基因如xx抗性基因或者某顯色基因，放入xx基因的平板上，利用選擇培養(yǎng)基的原理進(jìn)行培養(yǎng)，觀察其是否在平板上生長和顯色。
9.電泳檢測：用電泳儀。電壓一般采用5V/cm，可以有適當(dāng)?shù)碾妷翰睢囟仍?~30℃都可行，常在室溫下進(jìn)行。但電流過大時(shí)凝膠溫度升高，溶液蒸發(fā)，會造成電泳異常。將移液槍量程調(diào)至4μl，用其吸取DNA和染色劑，將其打入水平電泳槽中的凝膠的一排孔中(12個(gè)孔)，蓋上蓋子，用紫外凝膠顯色儀可以看見條帶，用DNAmarker對照看bp(堿基數(shù))是否正確。凝膠電泳兼有分子篩和電泳雙重效果，所以分離效率很高。應(yīng)用凝膠電泳可以正確的測定DNA片段的分子大小。
四、研究結(jié)論和反思
(一)結(jié)論
通過以上一系列實(shí)驗(yàn)，本人正確構(gòu)建定點(diǎn)單克隆突變，并保證突變出現(xiàn)的效率足夠高，確認(rèn)該實(shí)驗(yàn)可行性，通過參與實(shí)驗(yàn)確認(rèn)其具有足夠高的安全性和操作簡便性。單克隆操作流程嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)，卻有較高的簡便性，它有較高的使用價(jià)值和發(fā)展前景。
(二)反思
在一系列操作流程中，我也遇到了一些問題，通過對失敗經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，進(jìn)行以下反思：
1.在使用12頭移液槍將DNA混合染色劑注入凝膠的一排孔中的過程中失敗過幾次，原因在于未用手扶正移液槍，導(dǎo)致移液槍尖端扎入凝膠中，無法將液體導(dǎo)入小孔中進(jìn)行電泳操作。
2.實(shí)踐中存在構(gòu)建多個(gè)突變位點(diǎn)過程中，偶爾有幾個(gè)沒出現(xiàn)突變現(xiàn)象，原因在于模板基因依舊存在。
3.在轉(zhuǎn)移液體時(shí)也出現(xiàn)過轉(zhuǎn)移錯(cuò)離心管的問題，因此在操作過程中務(wù)必細(xì)心。
4.在進(jìn)行引物的稀釋這一實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備步驟的過程中，第一次并未先進(jìn)行離心操作后再開蓋加水，導(dǎo)致部分粘附在管蓋上的DNA干粉丟失。
5.涂平板時(shí)沒有在完全無菌的環(huán)境下進(jìn)行，導(dǎo)致菌落污染。
