發布時間：2020-03-09所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要背景：課題組前期研究首次發現骨髓基質細胞可以分泌中性粒細胞趨化因子 3，且在骨髓基質細胞調控神經干細胞分化為神經元的過程中中性粒細胞趨化因子 3 的表達上調 1.5 倍，提示中性粒細胞趨化因子 3 可能具有促進神經干細胞增殖與分化的作用。目的：觀察
摘要背景：課題組前期研究首次發現骨髓基質細胞可以分泌中性粒細胞趨化因子 3，且在骨髓基質細胞調控神經干細胞分化為神經元的過程中中性粒細胞趨化因子 3 的表達上調 1.5 倍，提示中性粒細胞趨化因子 3 可能具有促進神經干細胞增殖與分化的作用。目的：觀察中性粒細胞趨化因子 3 對新生大鼠海馬來源神經干細胞存活和增殖的影響。方法：體外分離培養新生 SD 大鼠海馬神經干細胞，將培養 3 代的神經干細胞分為對照組和中性粒細胞趨化因子 3 組，通過 MTS 法檢測細胞存活率，細胞生長曲線及活/死細胞染色觀察細胞存活及增殖情況，通過免疫熒光染色法及 Real-time PCR 檢測神經干細胞中 Nestin 的表達來觀察神經干細胞增殖情況。結果與結論：①隨著中性粒細胞趨化因子 3 質量濃度從 1 μg/L 增加至 20 μg/L，神經干細胞存活率逐漸增加，當質量濃度為 10 μg/L 時，神經干細胞存活率最高且細胞活力最好，再增至 20 μg/L 時，神經干細胞存活率無顯著增加;②中性粒細胞趨化因子 3 組 Nestin 染色陽性率明顯高于對照組(P < 0.05);③中性粒細胞趨化因子 3 組的 Nestin mRNA 表達量明顯高于對照組(P < 0.05);④結果表明，中性粒細胞趨化因子 3 對海馬來源神經干細胞具有促進存活和增殖的作用。
關鍵詞：中性粒細胞趨化因子 3;海馬;神經干細胞;細胞存活;細胞增殖;巢蛋白
0 引言 Introduction
神經干細胞是具有自我復制、分化能力的未分化細胞，在哺乳動物和人的大腦神經系統的發生和發展中，神經干細胞增殖分化為神經元和膠質細胞形成神經組織[1-2]，使之成為非常理想的細胞資源。大量實驗證據表明，神經干細胞移植對于神經系統疾病及損傷等具有臨床應用前景[3-6]。臨床治療神經系統疾病或損傷需要移植大劑量的神經干細胞，而神經干細胞體外培養過程復雜、增殖分化率低、移植存活率尚不樂觀，這些仍是神經醫學面臨的嚴峻挑戰[7]。因此，積極尋找有效的方法促進神經干細胞增殖將為臨床細胞移植治療提供重要的細胞來源。研究發現，神經干細胞的增殖分化極大程度上依賴于其生長的微環境，主要包括與神經干細胞相鄰的支持細胞、細胞外基質、細胞因子及微血管網等[8-10]。限制哺乳動物中樞神經系統再生的原因并非是缺乏足量的神經干細胞，而是缺乏刺激神經干細胞分化 所 必需 的 細胞 因子 [11] 。中 性 粒細 胞 趨化 因子 3 (cytokine-induced neutrophil chemoattractant 3，CINC-3) 是含ELR的CXC類趨化因子，主要由激活的單核細胞、內皮細胞、成纖維細胞產生[12]，它的生物學功能主要是在炎癥反應中可以誘導白細胞的趨化作用，與受體CXCR2有高度的親和力，該受體高度表達于中性粒細胞，促使它們黏附上皮細胞，通過血管壁遷移、組織入侵，產生氧自由基、脫顆粒和增加細胞內鈣濃度，進一步擴大炎癥反應[13-14]。在中樞神經系統中，CINC-3與其受體CXCR2結合可能產生抗凋亡、促進少突膠質細胞增殖和抑制其遷移的功能[15]，目前尚不明確CINC-3對神經干細胞和神經元的影響。該實驗以體外擴增培養的新生SD大鼠海馬神經干細胞為研究對象，通過CINC-3干預，探討CINC-3對神經干細胞存活和增殖的影響。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 設計 細胞學體外觀察實驗。
1.2 時間及地點 實驗于2018年8月至2019年1月在河北醫科大學第一醫院中心實驗室完成。
1.3 材料
1.3.1 實驗動物 清潔級新生24 h內SD大鼠，雌雄不限，由河北醫科大學實驗動物中心提供，動物使用許可證號： SCXK(冀)2018-004。實驗過程中對動物處置符合動物倫理學標準。
1.3.2 實驗試劑及儀器 二氧化碳培養箱(美國NAPCO 公司，型號：5420-I);倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司，型號：IX70);正置熒光顯微鏡(日本NIKON公司，型號80i); DMEM/F12(1 ∶ 1) 培養液 ( 美 國 GIBCO 公 司 ， 型 號 ： C11330);堿性成纖維細胞生長因子(美國PeproTech公司，型號：96-400-29-50);B27 Supplement (美國GIBCO，型號：17504-044);Nestin雞多克隆抗體(美國Abcam公司，型號：ab134017);RNA提取試劑盒(美國Promega公司，型號：LS1040);反轉錄試劑盒(美國Promega公司，型號： A5000) ; MTS 試劑盒 ( 美 國 Promega 公司，型號： 0000186480);山羊封閉血清(北京中杉金橋公司，型號 ZLI-9022)。
相關期刊推薦：《中國組織工程研究》雜于1997年創辦，發表組織工程研究中關于干細胞培養與移植、組織構建、材料生物相容性評價(天然或合成材料與納米粒子、人工材料植入體、植入器官及外源性細胞)、計算機輔助骨外科技術的應用基礎及臨床研究，轉化醫學和循證醫學研究的文章，發表中國組織工程研究領域一流水平的學術、技術創新成果。
1.4 實驗方法
1.4.1 神經干細胞的分離與培養 在無菌條件下，取出生 24 h內SD大鼠兩側海馬，置于預冷的DMEM/F12培養基中;解剖顯微鏡下剝離血管和腦膜，將分離出的海馬組織放入另一個預冷的DMEM/F12培養基中，緩慢輕柔吹打 15-20次后形成單細胞懸液;置于離心機中，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入無血清的神經干細胞培養基 (DMEM/F12培養基+2%B27+20 μg/L堿性成纖維細胞生長因子)重懸;計數后以5×107 L -1接種于25 cm2培養瓶中，再置于37 ℃、體積分數為5%CO2培養箱中培養。培養3 d半量補液，5-7 d后收集神經球，胰酶消化成單細胞計數后傳代[16-17]。選取2，3代神經干細胞用于實驗。
1.4.2 分組 實驗分為2組：對照組和CINC-3組。對照組第3代神經干細胞用無血清神經干細胞培養基(DMEM/F12 培養基+2%B27)培養;CINC-3組第3代神經干細胞加入不同質量濃度 CINC-3 干 預 ， 培 養 條 件 為 DMEM/F12+ 2%B27+1，5，10，20 μg/L CINC-3。
1.4.3 MTS檢測神經干細胞的存活率 將消化成單細胞的神經干細胞懸液接種至96孔培養板，每孔100 μL培養液，細胞密度為1×104 /孔，分為對照組和1，5，10，20 μg/L CINC-3組進行培養，每組5個復孔。培養5 d后，在每孔中加入20 μL CellTiter 96®AQueous One Solution Reagent，避光，在37 ℃、體積分數為5%CO2環境下孵育2 h后終止培養。使用空白對照孔調零，在酶標儀上測定490 nm處吸光度值，結果以吸光度值進行換算得出存活率。MTS檢測重復3次，取每組平均值進行統計學分析。
1.4.4 生長曲線觀察神經干細胞的增殖情況 將對照組及CINC-3組(選用MTS檢測結果中神經干細胞存活率最佳的CINC-3質量濃度)細胞機械吹打成單細胞懸液，以1× 108 L -1的細胞濃度接種至12孔板內，每組3個復孔，每天計數細胞個數，取其平均值，連續5 d，繪制生長曲線。
1.4.5 活/死細胞數染色觀察神經干細胞的存活情況 將對照組及CINC-3組神經干細胞(選用MTS檢測結果中神經干細胞存活率最佳的CINC-3質量濃度)用胰酶消化成單細胞懸液接種至12孔板內，加入0.4%錐蟲藍溶液均勻混合，對細胞進行染色，在3 min內光鏡下取不重疊的3個視野，計數活細胞及死細胞數目，以平均值計算細胞活力，連續 5 d，觀察細胞存活情況。
1.4.6 免疫熒光染色法觀察神經干細胞的增殖情況 將對照組和CINC-3組(選用MTS檢測結果中神經干細胞存活率最佳的CINC-3質量濃度)神經干細胞培養5 d后，接種于有預先包被0.01%多聚賴氨酸的玻片上培養，貼壁6-8 h后進行免疫熒光染色。各組細胞用0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min;40 g/L多聚甲醛室溫固定15 min，0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次5 min;山羊血清室溫封閉1 h，吸去血清，不洗;加入一抗(Nestin 1∶100)，4 ℃過夜;0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min;加入熒光二抗的山羊抗雞FITC(抗體工作濃度1∶100)，37 ℃避光孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min;Hoechst染核5 min，0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min;熒光顯微鏡觀察、照相。每組隨機選取上、中、下、左、右5個非重疊視野進行細胞計數，計算出每個視野的Nestin陽性細胞球數。
1.4.7 Real-time PCR觀察神經干細胞Nestin mRNA的表達 將對照組和CINC-3組(選用MTS檢測結果中神經干細胞存活率最佳的CINC-3質量濃度)神經干細胞培養5 d后，取5×106個細胞，提取總RNA，操作嚴格按試劑盒說明進行;反轉錄成cDNA，反應體系為20 μL，包含4 μL 5×miScritHiSpec溶液，2 μL 10×miScritNucleics混合液， 2 μL miScript反轉錄混合液，2 μL無RNA酶水和10 μL模板 RNA。以β-actin為內參，利用ABI 7500 PCR儀進行 Real-time PCR擴增反應。反應條件：95 ℃變性15 min， 94 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，重復32 次循環。β-actin上游引物序列為：5'-CCG CGA GTA CAA CCT TCT TG -3'，下游引物序列為：5'-TGA CCC ATA CCC ACC ATC AC-3';Nestin上游引物序列為：5'-GGG GGT AGG AGA TGC CTT TG -3'，下游引物序列為：5'-CCT TTA GAG CAC CCA CCT CC-3'，實驗結果重復3次，結果采用 2 -∆∆Ct法進行相對定量分析。
1.5 主要觀察指標 ①原代培養的神經干細胞形態及神經干細胞標志物Nestin的表達;②MTS檢測神經干細胞活力;③神經干細胞的生長曲線及存活情況;④免疫熒光法檢測神經干細胞的Nestin蛋白表達;⑤Real-time PCR檢測神經干細胞的Nestin mRNA表達。
1.6 統計學分析 采用SPSS 21.0軟件包處理數據，實驗結果用x _ ±s表示，兩組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)及SNK檢驗，P < 0.05為差異有顯著性意義。
2 結果 Results
2.1 神經干細胞培養及鑒定結果 原代分離的神經干細胞在倒置顯微鏡下觀察，細胞呈分散單個的圓球狀，并懸浮于培養基中，細胞具有良好的折光性。培養第3天，形成 3-5個細胞的圓形或不規則形狀小克隆神經球;培養第5-7 天，神經球由15-20個細胞聚集成克隆，神經球直徑明顯增大、較規則、飽滿，具有較強的折光性。傳代后，雜質細胞減少，神經球呈規則圓球形，折光性強，內部結構清晰，見圖1。用神經干細胞標志物Nestin對神經球進行染色，結果顯示神經球內大多數細胞呈Nestin染色陽性，見圖2。
2.2 CINC-3對神經干細胞活力的影響 1 μg/L CINC-3組細胞活力與對照組比較差異無顯著性意義(P > 0.05)，5， 10，20 μg/L CINC-3組細胞活力較對照組均增強，差異有顯著性意義(P < 0.05)，其中10 μg/L CINC-3組活力最佳， 20 μg/L CINC-3組與10 μg/L CINC-3組比較差異無顯著性意義(P > 0.05)，見圖3。
2.3 CINC-3對神經干細胞生長曲線的影響 通過連續計數對照組和10 μg/L CINC-3組的細胞個數，繪制出生長曲線，見圖4。從圖中可見，對照組及10 μg/L CINC-3組神經干細胞的生長呈持續增殖趨勢，培養前2 d細胞增殖速度較慢，培養3-5 d細胞增殖速度明顯加快，培養5 d后10 μg/L CINC-3組的細胞數目明顯高于對照組，增殖速率高于對照組，差異有顯著性意義(P < 0.05)。
2.4 錐蟲藍染色檢測活/死細胞數 連續5 d經錐蟲藍染色后計數活/死細胞數目，發現神經干細胞死細胞數目極少，對照組第 1-5 天 的 存 活 率 分 別 為 (99.303±0.068)% ， (99.267±0.306)%，(99.232±0.101)%，(99.240±0.649)%， (99.279±0.100)%，CINC-3組第1-5天的存活率分別為 (99.187±0.085)%，(99.306±0.881)%，(99.203±0.465)%， (99.213±0.205)%，(99.253±0.300)%，細胞存活率均在 99%以上，且對照組及CINC-3組的細胞存活率差異無顯著性意義(P > 0.05)。
2.5 免疫熒光染色檢測神經干細胞的Nestin蛋白表達 10 μg/L CINC-3組干預培養5 d，Nestin陽性神經球個數較對照組顯著增多(P < 0.05)，見圖5，6。
2.6 CINC-3對神經干細胞表達Nestin mRNA的影響 Real-time PCR檢測結果顯示，對照組和10 μg/L CINC-3 組干預培養5 d的Nestin mRNA表達量分別為1.007± 0.085，8.703±0.465，10 μg/L CINC-3組表達Nestin mRNA 水平明顯上升，明顯高于對照組(P < 0.05)。
3 討論 Discussion
神經干細胞是一類具有自我更新、多向分化的一類未成熟前體細胞[18]。在胚胎發育過程中，神經干細胞存在于神經管內，隨著生長發育的進行，其逐漸進入室管膜下區、紋狀體和海馬中并存留下來。成年哺乳動物的神經干細胞主要聚集于海馬齒狀回下層顆粒和側腦室的室管膜下區[19]。在哺乳動物的生命周期進程中，神經發生持續存在，海馬中的神經干細胞每天生成大量的神經元，遷移到發育中的神經系統，并不斷整合到現有的神經網絡中，成為成熟且具有功能的神經元，可以取代已經丟失的神經元，在學習和記憶貯存過程中發揮重要的作用[20-21]，故神經干細胞成為臨床治療神經系統疾病的種子細胞之一[22-23]。有研究表明，神經干細胞增殖能力下降會影響神經系統的修復和腦部功能的恢復，從而導致神經損傷和神經退行性疾病等[24]，同時會導致海馬結構發育異常，海馬是中樞神經系統管理學習能力和記憶功能的關鍵結構，其發育異常將導致學習和記憶功能障礙[25-26]。然而，成年哺乳動物體內神經干細胞數量較少，且多數處于靜息狀態。當機體發生損傷后，雖然能引起內源性神經干細胞增殖，但是再生能力極其有限，導致神經干細胞臨床治療存一定的局限性[27-28]。因此，探尋促進神經干細胞增殖的干預方法具有重要意義。該研究在體外原代分離新生SD大鼠海馬來源神經干細胞，倒置顯微鏡下觀察細胞呈分散單個的圓球狀，并懸浮于培養基中，細胞折光性良好;繼續培養3 d，形成3-5個細胞的圓形或不規則形狀小克隆神經球;培養5-7 d，神經球由15-20個細胞聚集成克隆，神經球直徑明顯增大、較規則、飽滿，具有較強折光性;傳代至第3代，免疫熒光染色顯示神經球內大多數細胞呈Nestin陽性，證明成功完成神經干細胞的體外原代分離、培養與鑒定，為后續實驗的順利開展奠定了基礎。
腦內的神經干細胞受微環境中多重信號如生長因子、轉錄因子、細胞外基質蛋白以及臨近各類細胞的影響，這些信號與神經干細胞發生直接或間接的作用，從而調控神經干細胞命運[29-32]。CINC-3是含ELR的CXC類趨化因子，在炎癥反應中可誘導白細胞的趨化作用[33-34]，在中樞神經系統中，CINC-3與其受體CXCR2結合可能產生抗凋亡、促進少突膠質細胞增殖和抑制其遷移的功能，并于炎癥過程中溝通著中樞神經系統和免疫系統，在二者之間起著橋梁的關鍵作用[35]。有研究證實，腦內CINC-3具有對抗神經退行性變和細胞死亡的新功能。當某一腦區受損，如缺血或腦外傷時，CINC-3會在損傷附近的腦脊液腔內積聚，這些炎癥細胞可能從這里遷移到腦實質，是中性粒細胞跨越上皮屏障遷移的先決條件[36]。在創傷或阿爾茨海默病等引起神經元損傷或者死亡時，星形膠質細胞可上調CINC-3的分泌，這一功能的實現可能與蛋白酶活化受體的激活有關[36-37]，通過向皮質神經元發出信號，進一步激活星形膠質細胞，使其刺激CINC-3分泌，CINC-3通過與其受體CXCR2結合，產生了神經保護作用，保護神經元不受神經退行性變和細胞死亡的影響[38-39]。作者前期研究發現，骨髓基質細胞調控神經干細胞分化的條件培養液中有7種細胞因子的表達上調明顯增加，其中CINC-3的表達上調了1.5倍[40]，由此推測CINC-3 可能具有促進神經干細胞增殖分化的作用。實驗結果顯示， 10 μg/L CINC-3對神經干細胞具有較好的促存活作用;生長曲線顯示CINC-3組細胞數目明顯高于對照組，增殖速度明顯加快，提示10 μg/L CINC-3有促進神經干細胞增殖的作用;進一步免疫熒光染色、Real-time PCR顯示，10 μg/L CINC-3促進神經干細胞表達Nestin，表明一定質量濃度的 CINC-3具有促進體外培養神經干細胞存活和增殖的作用。
綜上所述，在一定質量濃度范圍內CINC-3能正性調控新生大鼠海馬來源的神經干細胞存活和增殖。在后續的研究工作中，將深入探討CINC-3促進神經干細胞增殖的分子機制以及對神經干細胞分化的影響，將為治療神經系統疾病及發育期神經發生障礙提供新的視角。
SCISSCIAHCI
