發布時間：2020-02-26所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 內容提要：目的：合成含血管內皮生長因子緩釋微粒，并檢測其體外緩釋作用。方法：本實驗使用可降解高分子聚乳酸/乙醇酸共聚物，采用乳化分散法，對血管內皮生長因子進行包裹，制成可控制釋放的微粒。測定VEGF體外釋放情況并描繪成曲線。結果：制得VEGF的緩釋
內容提要：目的：合成含血管內皮生長因子緩釋微粒，并檢測其體外緩釋作用。方法：本實驗使用可降解高分子聚乳酸/乙醇酸共聚物，采用乳化分散法，對血管內皮生長因子進行包裹，制成可控制釋放的微粒。測定VEGF體外釋放情況并描繪成曲線。結果：制得VEGF的緩釋微粒大小約80~120nm。體外釋放檢測開始時為快速釋放期，隨后為緩慢持續釋放。結論：此實驗證實成功構建含血管內皮生長因子緩釋微粒。
關鍵詞：血管內皮生長因子聚乳酸/乙醇酸共聚物微粒顯微外科血管生成
血管吻合口處的血栓形成是術后最嚴重的并發癥，也是困擾著顯微外科醫生的重大問題。血管內皮生長因子是一種具有誘導和刺激內皮細胞生長的多肽，對組織修復有重要作用。本實驗使用可降解高分子聚乳酸/乙醇酸共聚物，采用乳化分散法，對血管內皮生長因子進行包裹，制成可控制釋放的微粒。以求解決臨床術后并發癥，提高血管通暢度。
1.材料與方法
1.1一般材料
試劑聚乳酸/乙醇酸共聚物(polylactic-co-glycolicacid，PLGA)(大連市中心醫院中心實驗室提供);兔抗人血管內皮生長因子多克隆抗體、VEGF-ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)。
主要試劑及儀器：二氯甲烷，丙酮，聚乙烯醇，沈陽化學試劑廠出品。
1.2方法
微粒的合成與制備：稱取1g聚乳酸/乙醇酸共聚物置于三口瓶中，加入20mL二氯甲烷和2mL丙酮，在800r/min的機械攪拌下滴加10mL兔抗人血管內皮生長因子多克隆抗體工作液，均勻乳化數分鐘后，加入30mL含2%聚乙烯醇(PolyvinylAlcohol，PVA)乳化劑的水溶液，攪拌2~3h。然后，在500mL的燒杯中，將上述乳化溶液倒入100mL0.3%的聚乙烯醇(PVA)水溶液中，以500r/min的速度攪拌24h，揮發除去二氯甲烷溶劑。
檢測血管內皮因子緩釋微粒大小：在旋轉蒸發器中除盡有機溶劑，所得微粒在濾器上抽濾收集，使用激光粒度分析儀測量微粒的平均粒徑。
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微粒中血管內皮因子的體外釋放的檢測：隨機稱取相同重量的15個微粒樣品(50mg)，分別混懸在10mL磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)的降解介質中，在濕度l00%、37?C恒溫箱中孵育，同時開始計時。在24h、48h、3d、5d、7d、15d、30d時分別吸取200μL上清液，同時補充等量釋放介質。上清液行VEGF含量檢測定量分析，并以時間為橫坐標、VEGF累計釋放量為縱坐標描繪VEGF的釋放曲線。
2.結果
2.1檢測血管內皮因子緩釋微粒大小
測試15份樣本激光粒度分析儀測量微粒的粒徑范圍為83~121nm，平均直徑為(104.25±17.03)nm。其中一份樣本測量直徑為53.27μm，考慮原因為多個微粒聚合而成，予以排除該樣本。
2.2微粒中血管內皮因子的體外釋放的檢測
1d時，微粒中的rhBMP-2釋放量為15.54%，表現為爆發性釋放，隨后釋放速度有所減慢，在第5d后又有一個快速釋放期，但速度小于第1個快速釋放期，第8d以后呈持續緩慢釋放，第13d開始每日釋放量明顯減少，并波動不大，第20d開始無明顯釋放量，后連續監測10d維持于43.71%，連續監測30d最大累積值為43.71%(見圖1)。
3.討論
小血管顯微吻合術后吻合口處的附壁血栓形成是最嚴重的術后并發癥[1,2]。有學者統計，即使是完善的術前設計、精細的顯微操作及及時的術后處理，小血管顯微吻合、組織游離移植的失敗率仍然在百分之十。其可能的機制[3-5]主要是小血管吻合口處有內皮細胞的損傷或缺失，常導致紅細胞、白細胞、血小板吸附聚集，當過多的血小板吸附與充填，最后導致血栓形成。吻合后血管與正常血管的最主要區別是缺乏內皮細胞覆蓋。內皮再生后，可減少血栓形成并有效防止血管外漏。故內皮術后有效再生是預防血管吻合并發癥的關鍵。
PLAG納米載體具有極高吸附性，進入生物體內后釋放藥物可以短時間達到有效血藥濃度并持續較長時間，緩釋微粒能直接作用于靶細胞等優點。本實驗所構成的載體使用激光粒度分析儀測量證實VEGF緩釋微粒大小為80~120nm。與其他載體不同，緩釋微粒具有2個快速釋放階段，從開始至第5d為第一個快速上升階段，而后的3d為第2個快速上升相持續階段，從第8d以后呈持續緩慢釋放，第13d開始每日釋放量明顯減少，并波動不大，以后呈緩慢持續釋放達20d。該實驗結果顯示VEGF緩釋微粒體外良好的釋放和緩釋功能。
實驗結果顯示VEGF緩釋微粒體外良好的釋放和緩釋功能。本實驗已成功構建富含血管內皮生長因子緩釋微粒，并體外釋放鑒定，說明PLGA納米粒是VEGF合適的緩釋載體材料。同時也為下一步動物實驗提供理論基礎。
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