發布時間：2020-02-25所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要背景：前期研究觀察到神經干細胞新分化的神經元表達甲酰基肽受體 2，并證實甲酰基肽受體 2 能促進神經干/祖細胞遷移，誘導向神經元分化。脊髓損傷組織中存在甲酰基肽受體 2 配體，然而不同的配體與甲酰基肽受體 2 結合可能導致不同、甚至相反的生物學效
摘要背景：前期研究觀察到神經干細胞新分化的神經元表達甲酰基肽受體 2，并證實甲酰基肽受體 2 能促進神經干/祖細胞遷移，誘導向神經元分化。脊髓損傷組織中存在甲酰基肽受體 2 配體，然而不同的配體與甲酰基肽受體 2 結合可能導致不同、甚至相反的生物學效應。
目的：探討脊髓損傷產生的配體與甲酰基肽受體 2 作用后對神經元突起生長的影響。
方法：采用酶消化法提取胎鼠大腦皮質神經元;制備 SD 大鼠脊髓損傷模型，提取損傷脊髓組織勻漿。①實驗分組 1：觀察甲酰基肽受體 2 激活對神經元突起的影響，分組如下：對照組、甲酰基肽受體 2 阻斷劑組(即添加 WRW4)、脊髓勻漿組、脊髓勻漿+WRW4 組;②實驗分組 2：觀察甲酰基肽受體 2 激活后 AKT 和 ERK 信號通路阻斷對神經元突起的影響，分組如下：對照組、AKT 和 ERK 信號通路阻斷劑組(即添加 Ly294002+PD98059)、脊髓勻漿組、脊髓勻漿+Ly294002+PD98059 組。神經元細胞貼壁 24 h 后，按上述分組處理 7 d，免疫熒光染色共聚焦顯微鏡觀察脊髓勻漿激活甲酰基肽受體 2 對神經元突起的影響;按上述分組處理 30 min，Western blotting 檢測磷酸化蛋白水平;按上述分組處理 24 h，Western blotting 檢測 F-actin 水平，觀察在甲酰基肽受體 2 特異性阻斷劑 WRW4 存在的情況下，對 MAPK 和 PI3K/Akt 通路中關鍵蛋白磷酸化的影響。
結果與結論：①脊髓損傷組織勻漿液能夠使神經元突起長度、初級分枝數、分枝節點數顯著增加，這種增加效應大部分被甲酰基肽受體 2 受體特異性阻斷劑 WRW4 阻斷;②脊髓損傷組織勻漿液能夠使神經元中 ERK1/2 和 Akt 的磷酸化增加，這種效應能夠被 WRW4 阻斷; ③Akt 信號通路阻斷劑 Ly294002 和 Erk 信號通路阻斷劑 PD98059 能夠阻斷脊髓勻漿的促進作用;④脊髓損傷組織勻漿能夠使 F-actin 表達量明顯增加，這種效應能夠被甲酰基肽受體 2 特異性阻斷劑 WRW4 所阻斷;⑤這些實驗結果說明，脊髓勻漿液能夠通過激活甲酰基肽受體 2 促進神經元突起生長，這種作用機制可能與 ERK1/2 和 Akt 的磷酸化增加相關。
關鍵詞：脊髓損傷;脊髓損傷組織勻漿;神經元;甲酰基肽受體;軸突生長;Akt 信號通路;Erk 信號通路
0 引言
Introduction 脊髓損傷具有發病率高、死亡率低等特點，給患者身心健康、家庭經濟負擔和社會醫療帶來了巨大的壓力。因此，加強脊髓損傷神經功能修復的基礎及臨床研究具有重大意義。
脊髓損傷后，損傷平面上下之間的物理聯系(即下行運動軸突和上行感覺軸突的損傷)中斷，導致脊髓信息傳遞功能受阻，使得損傷平面以下感覺和運動障礙。軸突再生并與靶細胞形成突觸聯系是修復脊髓信息傳遞功能的關鍵之一。
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軸突再生機制非常復雜，受眾多因素的調節和影響。中樞神經系統損傷、缺血等病理情況下產生許多種類的因子，在軸突再生過程中發揮重要的作用，如神經營養因子、炎癥因子、趨化因子等。近年來，趨化因子及其受體對軸突再生的作用逐漸成為研究的熱點[1-4]。甲酰基肽受體 (formyl peptide receptors，FPRs)是化學性趨化因子受體。前期研究觀察到神經干細胞表達甲酰基肽受體2，并證實甲酰基肽受體2能促進神經干/祖細胞遷移，誘導向神經元分化[5]。國內外研究證實神經元也表達甲酰基肽受體[5-7]。該研究擬進一步探討甲酰基肽受體2激活能否促進神經元軸突生長及其機制，希望能為治療脊髓損傷等神經系統疾病提供新的思路。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 設計 細胞學實驗。
1.2 時間及地點 實驗于2016年1至10月在陸軍軍醫大學附屬第二醫院中心實驗室完成。
1.3 材料
1.3.1 實驗動物 SPF級12.5 d齡SD孕鼠(提取胎鼠大腦皮質神經元)，10只SPF級雄性SD大鼠10只(制備脊髓勻漿，2月齡，體質量200-250 g)，由中國人民解放軍特色醫學中心實驗動物中心提供。所有有關實驗動物的操作均按國際通用實驗室動物使用指南和解放軍陸軍軍醫大學動物實驗管理使用規定執行，以最大限度減少實驗動物用量及減輕實驗動物痛苦。
1.3.2 實驗藥品與試劑 p-Akt、Akt、p-Erk、Erk、p-p38、 p38、F-actin、β-Ⅲ tubulin一抗(Abcam公司);GAPDH一抗(碧云天生物技術公司);甲酰基肽受體2受體特異性阻斷劑WRW4(Tocris公司);DMEM/F12、優質胎牛血清、 Accutase消化液(Gibco公司);Neurobasal培養基(Life Technologies);Akt信號通路阻斷劑Ly294002、ERK1/2 信號通路阻斷劑PD98059(Sigma公司);多聚鳥氨酸及其他未注明來源的試劑(Sigma公司)。
1.3.3 實驗器材 低溫離心機、酶標儀(美國Thermo scientific公司);激光共聚集顯微鏡(德國Carl Zeiss公司);倒置顯微鏡(日本Olympus公司);37 ℃含體積分數為 5%CO2孵育箱(美國Thermo Forma公司);Western Blot 電泳儀、轉膜儀(北京六一儀器廠)。
1.4 實驗方法
1.4.1 神經元培養 采用酶消化法提取胎鼠大腦皮質神經元。簡述如下：以頸椎脫臼方法處死孕12.5 d SD大鼠，取出胎鼠，分離出大腦皮質，剝除腦膜，用眼科剪將組織塊剪碎。加入適量0.25%胰蛋白酶，于37 ℃消化12 min，用2倍體積含體積分數為10%胎牛血清的DMEM/F12終止消化，巴氏吸管輕輕吹打，取出上清，將沒有消化的組織塊重復上面步驟再次消化和終止消化，直至組織塊完全消化。將每次收集的上清以100 μm細胞過濾器進行過濾，離心(1 000 r/min， 5 min)后，用含有B27(2%)、谷氨酰胺(0.5 mmol/L)的 Neurobasal培養基重懸，置于37 ℃恒溫培養箱培養。 。
1.4.2 脊髓勻漿的制備 根據Fehlings的方法制作脊髓損傷模型[21-22]。簡述如下：10只SPF級SD大鼠，5%水合氯醛按350 mg/kg行腹腔麻醉，固定于小動物手術臺上。縱向切開背部皮膚，切口長約1 cm，鈍性分離頸后脂肪墊。注意避免損傷該處大靜脈，防止大出血。暴露棘突和椎板，確定T10，T11椎體位置。用文氏鉗小心咬去T10棘突及相應椎板，充分暴露脊髓。采用小號動脈夾，鉗夾脊髓30 s， 損傷脊髓。鉗夾完畢后，用生理鹽水沖洗傷口，無菌縫合。術后第2天，無菌條件下取損傷處脊髓節段約1 cm×1 cm，加入5 mL DPBS進行勻漿，勻漿液12 000 r/min離心5 min，收集上清液即為脊髓勻漿，上清液-70 ℃保存備用
1.4.3 實驗分組 ①觀察甲酰基肽受體2激活對神經元突起的影響，分組如下：對照組、甲酰基肽受體2阻斷劑組(即添加WRW4)、脊髓勻漿組、脊髓勻漿+WRW4組;②觀察甲酰基肽受體2激活后AKT和ERK信號通路阻斷對神經元突起的影響，分組如下：對照組、AKT和ERK信號通路阻斷劑組(即添加Ly294002+PD98059)、脊髓勻漿組、脊髓勻漿+Ly294002+PD98059組。
1.4.4 免疫熒光染色及共聚焦顯微鏡觀察 細胞貼壁 24 h后，分別給予脊髓勻漿、相應阻斷劑處理。在添加脊髓勻漿之前30 min，分別添加WRW4(終濃度0.4 μmol/L) 或 Ly294002( 終濃度 10 μmol/L)+PD98059( 終濃度 10 μmol/L)，作用7 d后，進行神經元細胞標志物(β-Ⅲ tubulin)抗體免疫熒光染色。簡述步驟如下：加入20 g/L多聚甲醛室溫固定15 min，0.5% Triton X-100透膜15 min，血清封閉1 h，4 ℃一抗孵育過夜，室溫二抗孵育2 h，DAPI 復染5 min，激光共聚焦顯微鏡成像分析。在每高倍鏡視野中計數神經元數量，測量神經元分枝的長度，計數初級分枝數、分枝節點數。
1.4.5 Western blotting實驗 各組細胞作用30 min后，測量磷酸化蛋白水平，各組細胞作用24 h后，測量F-actin水平。提取神經元總蛋白，BCA法測定蛋白濃度;取等量蛋白(50 μg)，上樣，電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h;p-Akt、 Akt、p-Erk、Erk、p-p38、p38、F-actin抗體(1∶1 000)、 GAPDH單克隆抗體(1∶5 000) 4 ℃孵育過夜;TBST洗膜 3次，每次10 min，二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔/ 小鼠IgG(1∶5 000)室溫孵育2 h，洗膜3次，每次10 min;加顯色劑，Chemi Doc XR+凝膠成像儀掃描成像，條帶分析測定使用Image Lab程序。
1.5 主要觀察指標 ①免疫熒光染色共聚焦顯微鏡觀察神經元突起的長度、初級分枝數、分枝節點數;②Western blotting實驗觀察神經元經過不同處理后信號通路分子 p-Akt、Akt、p-Erk、Erk、p-p38、p38及細胞骨架分子F-actin 表達。
1.6 統計學分析 采用SPSS 18.0統計學軟件，計量資料以x _ ±s表示，進行方差分析，P < 0.05為差異有顯著性意義。
1.4.3 實驗分組 ①觀察甲酰基肽受體2激活對神經元突起的影響，分組如下：對照組、甲酰基肽受體2阻斷劑組(即添加WRW4)、脊髓勻漿組、脊髓勻漿+WRW4組;②觀察甲酰基肽受體2激活后AKT和ERK信號通路阻斷對神經元突起的影響，分組如下：對照組、AKT和ERK信號通路阻斷劑組(即添加Ly294002+PD98059)、脊髓勻漿組、脊髓勻漿+Ly294002+PD98059組。
1.4.4 免疫熒光染色及共聚焦顯微鏡觀察 細胞貼壁 24 h后，分別給予脊髓勻漿、相應阻斷劑處理。在添加脊髓勻漿之前30 min，分別添加WRW4(終濃度0.4 μmol/L) 或 Ly294002( 終濃度 10 μmol/L)+PD98059( 終濃度 10 μmol/L)，作用7 d后，進行神經元細胞標志物(β-Ⅲ tubulin)抗體免疫熒光染色。簡述步驟如下：加入20 g/L多聚甲醛室溫固定15 min，0.5% Triton X-100透膜15 min，血清封閉1 h，4 ℃一抗孵育過夜，室溫二抗孵育2 h，DAPI 復染5 min，激光共聚焦顯微鏡成像分析。在每高倍鏡視野中計數神經元數量，測量神經元分枝的長度，計數初級分枝數、分枝節點數。
1.4.5 Western blotting實驗 各組細胞作用30 min后，測量磷酸化蛋白水平，各組細胞作用24 h后，測量F-actin水平。提取神經元總蛋白，BCA法測定蛋白濃度;取等量蛋白(50 μg)，上樣，電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h;p-Akt、 Akt、p-Erk、Erk、p-p38、p38、F-actin抗體(1∶1 000)、 GAPDH單克隆抗體(1∶5 000) 4 ℃孵育過夜;TBST洗膜 3次，每次10 min，二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔/ 小鼠IgG(1∶5 000)室溫孵育2 h，洗膜3次，每次10 min;加顯色劑，Chemi Doc XR+凝膠成像儀掃描成像，條帶分析測定使用Image Lab程序。
1.5 主要觀察指標 ①免疫熒光染色共聚焦顯微鏡觀察神經元突起的長度、初級分枝數、分枝節點數;②Western blotting實驗觀察神經元經過不同處理后信號通路分子 p-Akt、Akt、p-Erk、Erk、p-p38、p38及細胞骨架分子F-actin 表達。
1.6 統計學分析 采用SPSS 18.0統計學軟件，計量資料以x _ ±s表示，進行方差分析，P < 0.05為差異有顯著性意義。
2 結果 Results
2.1 大鼠脊髓損傷組織勻漿液通過甲酰基肽受體2促進神經元突起生長 共聚焦顯微鏡觀察結果顯示：與對照組相比，勻漿液能夠使神經元突起的長度、初級分枝數、分枝節點數顯著增加，這種增加效應大部分能夠被甲酰基肽受體2受體特異性阻斷劑WRW4阻斷，見圖1。實驗結果說明脊髓損傷組織勻漿液能夠通過甲酰基肽受體2促進神經元突起生長，同時這種作用具有特異性。
2.2 大鼠脊髓損傷組織勻漿液通過甲酰基肽受體2引起 ERK1/2和Akt的磷酸化 為了探究甲酰基肽受體2激活對軸突生長促進作用的相關信號通路，實驗檢測了甲酰基肽受體2激活對MAPK和PI3K/Akt通路中關鍵蛋白磷酸化作用的影響。Western blotting實驗結果提示：與對照組相比，脊髓勻漿液能夠促使神經元中ERK1/2和Akt的磷酸化，而對MAPK通路中另一關鍵蛋白p38的磷酸化無明顯影響，見圖2;相反，利用甲酰基肽受體2受體特異性阻斷劑WRW4 進行阻斷，發現不論是ERK1/2還是Akt的磷酸化都顯著下降。這些實驗結果說明，甲酰基肽受體2激活通過磷酸化 ERK1/2和Akt促進軸突生長。
2.3 大鼠脊髓損傷組織勻漿液通過ERK1/2和Akt磷酸化促進神經元突起生長 為了更進一步觀察ERK1/2和Akt在甲酰基肽受體2促進神經元突起生長中的作用，又進行了相應的阻斷實驗。實驗結果提示：脊髓勻漿促進神經元突起生 長 的 作 用 ， 能 夠 被 ERK1/2 和 Akt 信 號 通 路 阻 斷 劑 Ly294002和PD98059阻斷，見圖3。
2.4 大鼠脊髓損傷組織勻漿液通過甲酰基肽受體2引起 F-actin表達量增加 細胞骨架F-actin在神經元突起生長中起著重要的作用，為了進一步探討甲酰基肽受體2激活促進神經元突起生長的機制，實驗觀察了甲酰基肽受體2對 F-actin的影響。與對照組相比，脊髓損傷組織勻漿液能夠使神經元F-actin表達量顯著增加，這種增加效應大部分能夠被甲酰基肽受體2受體特異性阻斷劑WRW4阻斷，見圖 4。這些實驗結果說明脊髓損傷組織勻漿液能夠通過甲酰基肽受體2促進F-actin的表達導致神經元突起生長，同時這種作用具有特異性。
3 討論 Discussion
甲酰基肽受體是G蛋白偶聯受體(GPCR)家族的主要成員，包括甲酰基肽受體1和甲酰基肽受體2，人類還有甲酰基肽受體3 [8-11]。甲酰基肽受體是化學性趨化因子受體，具有多種配體，如fMLP，Annexin A1等[12-14]，不同配體與甲酰基肽受體結合可能導致不同、或者相反的生物學效應[15-19]。這些配體存在于損傷或感染的組織中[20-22]，在細胞死亡或細胞功能障礙時，細胞中的線粒體可以釋放這些配體[23]，同時這些配體也可以來源于細菌或病毒蛋白[24-26]。作者在以前的實驗中觀察到脊髓損傷時能夠產生甲酰基肽受體的配體。甲酰基肽受體首先在中性粒細胞、單核細胞中發現[6，27-29]，在創傷或感染性炎癥中，甲酰基肽受體的激活促進中性粒細胞、單核細胞遷移，增強吞噬作用，提升機體免疫力。近年來，甲酰基肽受體在非吞噬性細胞中的表達和作用也進行了廣泛的研究，如間充質干細胞[30]、結腸創面上皮細胞[31]、內皮祖細胞[32]、神經細胞等[33]。
在目前觀察到的細胞中，甲酰基肽受體的主要作用是促進細胞遷移。細胞遷移和軸突生長及延伸均由細胞骨架的極性排布而實現，因此甲酰基肽受體理論上具有促進軸突生長及延伸的作用。作者及國內外多家實驗室研究證實神經干細胞表達甲酰基肽受體[7，18，34-35]。同時作者前期研究觀察到甲酰基肽受體在體內外均能促進腦源性神經干細胞的遷移、分化，神經元表達甲酰基肽受體，并且甲酰基肽受體激活能夠促進神經干細胞新分化的神經元觸突生長 及突起分枝增多[7]。HO等[36]最近研究發現甲酰基肽受體2 在腦干和脊髓中高水平表達，甲酰基肽受體2抑制劑 PBP10或者WRW4能夠抑制神經軸突的生長和抑制突起的形成。KORIMOVá等[6]研究證實許旺細胞中也表達甲酰基肽受體2，并能促進許旺細胞突起的生長，這對于 Wallerian變性后軸突再生十分有利。
該研究進一步研究了脊髓損傷后促進神經元突起生長的作用和機制。采用脊髓損傷后組織勻漿作用于神經元，觀察到脊髓勻漿能夠促進神經元突起長度、初級分枝數、分枝節點數顯著增加，同時這種作用大部分能夠被甲酰基肽受體2特異性阻斷劑WRW4所阻斷，提示甲酰基肽受體2 的激活能夠促進神經元突起生長。同時觀察到WRW4并不能完全阻斷脊髓勻漿的促進作用，提示脊髓勻漿內還有其他因素作用，這可能與脊髓勻漿不是單一成分有關，同時也提示如果要獲得促進神經元突起生長的最大效應，需要多因素的綜合作用。這些因素之間如何組合才能發揮彼此之間協同效應，這需要進一步研究。
實驗結果提示脊髓損傷組織勻漿液能夠使神經元中 ERK1/2和Akt的磷酸化，而對MAPK通路中另一關鍵蛋白 p38的磷酸化無明顯影響，利用甲酰基肽受體2受體特異性阻斷劑WRW4進行阻斷，發現不論是ERK1/2還是Akt的磷酸化都顯著下降。同時Akt信號通路阻斷劑Ly294002和Erk 信號通路阻斷劑PD98059能夠阻斷脊髓勻漿的促進作用，這些實驗結果說明甲酰基肽受體2激活通過磷酸化ERK1/2 和Akt促進軸突生長。在創傷或感染性炎癥中，甲酰基肽受體與其配體結合后觸發Erk1/2、Junk等多種信號反應并促進炎癥細胞遷移，增強吞噬能力以及上調活性氧，從而增強機體免疫能力[32]。
作者前期實驗研究證實，甲酰基肽受體2的激活能夠導致神經干細胞的遷移增加，可能與F-actin表達量增加有關。 F-actin是細胞骨架重要的分子，不僅與細胞遷移相關，在細胞中還與突起的生長相關，因此進一步觀察了脊髓勻漿對F-actin表達影響，結果提示脊髓勻漿能夠使F-actin表達量明顯增加，這種效應能夠被甲酰基肽受體2特異性阻斷劑 WRW4所阻斷，說明脊髓勻漿能夠通過促進F-actin的表達量增加，促進神經元突起的生長。
總之，實驗探討了脊髓損傷產生的配體與甲酰基肽受體2 作用后對神經元突起的影響并初步探索了可能的機制，為明確甲酰基肽受體2在神經發生中的作用提供新的理論基礎，也為治療脊髓損傷或者腦損傷提供新的潛在的治療靶點。
SCISSCIAHCI
