發布時間：2020-02-24所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要背景：人類白細胞抗原 HLA 經過長期進化形成豐富的多態性，近幾年由于受檢人數增加及 HLA 分型技術快速發展，HLA 新基因不斷被發現。 目的：采用下一代測序技術對 1 例白血病患者及家系 HLA-B 基因的全長序列及 18 個點突變進行分析。方法：應用序列特異
摘要背景：人類白細胞抗原 HLA 經過長期進化形成豐富的多態性，近幾年由于受檢人數增加及 HLA 分型技術快速發展，HLA 新基因不斷被發現。
目的：采用下一代測序技術對 1 例白血病患者及家系 HLA-B 基因的全長序列及 18 個點突變進行分析。方法：應用序列特異性寡核苷酸探針雜交(PCR-SSOP)及聚合酶鏈反應-直接測序法(PCR-SBT)發現患者的 HLA-B 結果異常。為了鑒定該基因，采用下一代測序技術對該基因全長進行測序，同時采集患者父親、母親及 2 位同胞姐妹的血樣進行 HLA 基因的遺傳學分析。結果與結論：應用序列特異性寡核苷酸探針雜交及聚合酶鏈反應-直接測序法均提示該樣本 HLA-B 無完全匹配的基因型。應用下一代測序技術分析發現，與同源性最高的等位基因 B*15:09:01 相比，該基因在外顯子、內含子和 3′UTR 共存在 18 個堿基突變。5 個外顯子堿基突變位于第 3，4 外顯子，分別為：第 486 位 G→C、第 583 位 T→C、第 636 位 T→C、第 652 位 A→G 和第 756 位 C→T，導致 5 個相應密碼子發生改變，其中 2 個堿基替換為錯義突變，第 171 位酪氨酸(Tyr)→組氨酸(His)、第 194 位異亮氨酸(Ile)→纈氨酸(Val)。家系調查顯示患者 HLA-B 新基因來源于父親。新基因序列已遞交給 Genbank 數據庫(MG595995)。應用下一代測序技術鑒定了 1 個 HLA-B 新等位基因，該基因于 2017 年 12 月被 WHO HLA 因子命名委員會正式命名為 HLA-B*15:435。
關鍵詞：白血病;人類白細胞抗原;新等位基因;下一代測序技術;家系調查;堿基突變;序列特異性寡核苷酸探針雜交;聚合酶鏈反應-直接測序法
0 引言
Introduction 人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)是位于6號染色體短臂上緊密相連的基因簇，與機體的自我識別和免疫應答密切相關，在長期的進化過程中形成了高度多態性和不同種族、不同地域獨特的分布特征[1-2]。自1958 年第1個HLA抗原被發現以來，越來越多的研究表明其在移植排斥反應、疾病相關性研究和法醫學等多個領域均有緊密關聯[3-5]。精準的HLA分型結果為器官移植、造血干細胞移植、疾病相關性研究、親子鑒定、群體遺傳學等提供了基礎數據[6-7]。截止到2018年10月為止，已發現的HLA等位基因有 20 088 個，其中 HLA-B 有 5 590 個等位基因 (https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/stats)。作者所在實驗室應用序列特異性寡核苷酸探針雜交(polymerase chain reaction and sequence-specific oligonucleotide probes， PCR-SSOP)和聚合酶鏈反應-直接測序法(polymerase chain reaction-sequence based typing，PCR-SBT)對臨床樣本HLA分型時發現結果異常，對疑似為新基因的樣本采用基于 ION S5TM 測 序 系 統 的 下 一 代 測 序 技 術 (next generation sequencing，NGS)進行鑒別，鑒定了一個 HLA-B新等位基因。新的基因序列已提交至Genbank (MG595995)。該基因于2017年12月被世界衛生組織HLA 因子命名委員會正式命名為HLA-B*15:435，現將該基因的檢測、鑒定、全長序列分析及家系調查報道如下。
1 對象和方法 Subjects and methods
1.1 設計 應用PCR-SSOP、PCR-SBT和NGS聯合檢測樣本，并進行家系調查。
1.2 時間及地點 于2017年6月在深圳市血液中心輸血醫學研究所完成HLA分型檢測。
1.3 對象 1名患有急性髓細胞白血病的女性患者，籍貫廣東，漢族。2017年6月到作者所在實驗室做造血干細胞移植前配型時發現HLA-B分型結果異常。在征得知情同意后，采集其一級家屬包括父親、母親、同胞姐妹的EDTA 抗凝全血做家系調查分析。
1.4 方法
1.4.1 實 驗 試 劑 和 儀 器 核酸提取試劑 ( 批 號 ： S4101-18005)(中國臺灣芮寶公司);LABTypeTM SSO 流式磁珠分型試劑(批號：LOT 005)(美國One Lambda公司); SeCoreTM測序試劑盒(批號：LOT 007)(美國One Lambda 公司);NXTypeTMNGS試劑盒(批號：LOT 002)(美國One Lambda公司);全自動核酸提取儀(中國臺灣芮寶公司); ND 2000型超微量紫外分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司);FLEXMAP-3D型多功能高通量流式熒光點陣儀(美國One Lambda公司);3730型序列分析儀(美國ABI 公司);9700型基因擴增儀(美國ABI公司);ION S5TM測序儀(美國One Lambda公司)。
1.4.2 基因組DNA制備 按照臺灣芮寶magcore?的試劑說明，采用全自動核酸提取儀提取基因組DNA。用超微量紫外分光光度計(型號：ND2000)檢測DNA濃度及純度， DNA質量濃度在20-70 mg/L，A260/A280在1.70-1.90。
1.4.3 PCR-SSOP 采 用 美 國 One Lambda 公 司 LABType SSO試劑對HLA-A、-C、-B、-DRB1、-DQB1 5 個位點進行特異性擴增。在96孔雜交板加入1.5 μL的變性液與3.0 μL的擴增產物于室溫下反應10 min，加入中和液;將稀釋后的磁珠加入至各孔，于60 ℃孵育15 min后加入洗液洗滌;4 000 r/min離心，甩掉上清液，再加入洗滌液，重復洗滌3次;加入配好的熒光標記，60 ℃孵育5 min，洗滌1次后加入緩沖液，轉移到上機板后放入Luminex流式磁珠儀讀取，結果用HLA Fusion 4.2軟件判讀。
1.4.4 PCR-SBT(Sanger測序) 嚴格按照美國Thermo Fisher Scientific 公 司 SeCoreTM 分 型 試 劑 盒 說 明 書 對 HLA-A、-C、-B、-DRB1、-DQB1 5個位點進行特異性擴增，每孔加入4 μL ExoSAP-IT純化，純化后的產物進行正反向測序;測序產物經醋酸乙醇沉淀法純化后，加入15 μL 甲酰胺，95 ℃變性2 min，在ABI 3730測序儀上進行毛細管電泳。測序結果導入uTYPE7.2軟件。
1.4.5 下一代測序分型(ION S5TM測序平臺) (1)DNA擴增和定量：嚴格按照美國One Lambda公司 NXTypeTM NGS試劑盒的試劑說明特異性擴增HLA Ⅰ類 (A、C、B位點)全長，Ⅱ類(DRB1和DQB1位點)擴增第2， 3外顯子。使用AMPure Xp磁珠對擴增產物純化后，用 Qubit? dsDNA HS Assay 試劑盒對產物進行定量。把Ⅰ類和Ⅱ類產物進行等摩爾混合。
(2)文庫構建：應用ION ShearTMPlus試劑，把擴增產物隨機片段化，片段兩段接上小片段序列接頭，篩選300- 1 000 bp目標片段進行2次擴增，純化后用Agilent 2200 TapeStation最終定量，制備文庫。
peStation最終定量，制備文庫。 (3)乳化PCR產物：經過乳化后在40 ℃等溫擴增條件下，將小片段結合在磁珠ISP上進行單克隆擴增，篩選出富集ISP珠子作為測序模板終產物，加載至Ion 530TM Chip芯片上，在ION S5測序平臺上分別加入4種脫氧核苷酸，開始測序。
(4)數據分析：用TypeStream VisualTM NGS Analysis Software軟件進行數據處理和分析。
1.5 主要觀察指標 患者及家系成員的HLA流式分型結果、PCR-SBT分型結果、NGS全長測序結果、核苷酸和氨基酸序列比對。
2 結果 Results
2.1 PCR-SSOP分型結果 將家系中各成員的流式分型數據導入軟件分析，結果見表1。患者和其父親HLA-B位點磁珠格局異常，提示736號磁珠假陽性且調整不合理，不能指定為任意確定的等位基因型。
2.2 PCR-SBT(Sanger測序)分型結果 將序列導入 uTYPE 7.2分析軟件發現，患者及其父親HLA-B位點的測序結果無完全匹配的基因型。與最接近的B*15:09:01， B*46:01/B*15:09:01，B*48:01基因型相比，均存在5個堿基突變點，患者及父親的堿基突變點位置相同，分別位于第3外顯子的第486位和第583位，第4外顯子的第636位、第652位和第756位，見圖1。
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2.3 下一代測序分型技術 NGS對HLA Ⅰ類位點全長進行測序，發現患者和父親均攜帶1個HLA-B新等位基因，新等位基因序列完全相同。與同源性最高的等位基因 B*15:09:01相比，新等位基因在第3和第4外顯子上存在5 個堿基突變，突變點位置分別為第486位G→C、第583位 T→C、第636位T→C、第652位A→G和第756位C→T，與 Sanger法檢測的突變點位置一致，見圖2。導致了5個相應密碼子發生改變，其中3個屬于同義突變，編碼氨基酸不發生改變，分別為第138位蘇氨酸(Thr)、第188位組氨酸(His) 和第228位蘇氨酸(Thr);另外2個堿基替換為錯義突變，第 171位密碼子編碼的氨基酸由酪氨酸(Tyr)變為組氨酸 (His)，第194位密碼子編碼的氨基酸由異亮氨酸(Lle)變為纈氨酸(Val)。同時，NGS檢測出新基因與HLA-B*15:435 相比存在11個內含子及2個3′UTR的堿基突變，其中第3內含子有3個點突變，第4內含子有2個點突變，第5內含子有 6個點突變。堿基突變位置分別為：第1 211位G→A、第1 215 位G→C、第1 468位C→A、第1 871位G→C、第1 916位 A→G、第2 233位A→G、第2 242位G→A、第2 274位C→T、第2 377位C→T、第2 414位T→G、第2 449位T→C、第 2 910位G→T、第2 978位C→T。在NGS分析軟件上序列圖譜見圖3和圖4。
2.4 命 名 新 基 因 序 列 已 遞 交 給 Genbank 數據庫 (MG595995)，并于2017年12月被WHO HLA因子命名委員會正式命名為HLA-B*15:435。
2.5 家系調查分析 根據基因測序分型結果分析，患者 HLA-B*15:435新等位基因遺傳于父親。其母親及2位同胞姐妹HLA配型結果均在中國常見及確認的HLA等位基因表 (CWD)中，2位同胞姐妹未遺傳父親含有新等位基因的單倍型。家系成員的單倍型見表2。
3 討論 Discussion
HLA-B是HLA經典Ⅰ類抗原，編碼的蛋白質產物以糖蛋白的形式幾乎表達于所有有核細胞膜表面，通過呈遞自身或異體抗原給CD8+ T細胞，在自我識別、調節免疫反應和對異體移植排斥中發揮重要作用[8-10]。HLA-B全長包含7個外顯子和6個內含子，是目前HLA系統中多態性最復雜的基因座。目前IPD-IMGT/HLA數據庫(3.34版，2018-10)中 HLA-B基因有5 590個等位基因，其中超過60%的等位基因缺少全長序列。作者發現的新等位基因HLA-B*15:435與同源性最高的等位基因HLA-B*15:09:01相比，在第3、4外顯子上存在5個堿基差別，分別是第486位G→C、第583位 T→C、第636T位→C、第652位A→G和第756位C→T，5 個突變點均為外顯子多態性位點。突變導致了5個相應密碼子發生改變，由于遺傳密碼子的簡并性，其中3個密碼子編碼的氨基酸不發生改變，另外2個堿基替換為錯義突變，第 171位密碼子編碼的氨基酸由酪氨酸(Tyr)變為組氨酸 (His)，第194位密碼子編碼的氨基酸由異亮氨酸(Lle)變為纈氨酸(Val)。由于HLAⅠ類第2，3外顯子分別編碼a重鏈的a1和a2結構域，而a1和a2共同組成抗原肽結合槽，因此，第3外顯子第171位氨基酸的改變，可能改變抗原肽的結合能力及TCR識別作用，從而引起不同的免疫應答。應用下一代測序技術進一步分型發現，該新基因與 HLA-B*15:09:01相比同時存在11個內含子和2個3′UTR非翻譯區的堿基突變，這在以往國內外關于新基因的報道中是少見的[11-15]。有趣的是，HLA-B*15組等位基因內含子區域同源性較高，而該新基因11個內含子突變堿基與大部分 B*15 組 的 等 位 基 因 不 同 ， 但 是 與 HLA-B*15:20 ， HLA-B*15:228相比，這11個內含子突變位置及堿基變化完全一致。進一步分析發現，新基因與B*15組HLA-B*15:20， HLA-B*15:228 及 其 他 組 的 HLA-B*35:01:01:01 、 HLA-B*51:01:01:01、HLA-B*53:01:01:01、HLA-B*58:01: 01:01從第3內含子開始到第7外顯子區域基因序列完全一致，但是在其他區域與B15的同源性較高。內含子在過去被認為不編碼基因片段，在臨床和科研工作中容易被忽視。近幾年的研究認為，內含子可能影響剪切體的產生，進而影響HLA分子結構和表達水平[16]。最新的研究發現，HLA-B 第4內含子編碼微小RNA，這些微小RNA在體外影響多個轉錄本的表達，影響各種新陳代謝途徑和免疫應答網絡[17-18]。該新基因的堿基突變是否引起功能變化，尚有待進一步研究。
國內外學者的研究表明，HLA-B與疾病有著非常緊密的聯系。HLA-B27經過幾十年的研究與臨床實踐，發現與強直性脊柱炎有極強的關聯性，大于90%的患者攜帶該基因[19-21]。謝彥昕等[22]通過Meta分析，認為HLA-B*37和 HLA-B*46 是 人 類 免 疫 缺 陷 病 毒 的 易 感 性 基 因 ， 而 HLA-B*39恰巧相反，是其保護性基因。EYIOL等[23]發現 HLA-B35、HLA-B44等位基因與風濕性心臟病密切相關。以上文獻表明，HLA在多種疾病中扮演重要的角色，準確分型是研究和臨床應用的基礎。目前HLA常規分型檢測方法主要是PCR-SSOP和PCR-SBT。PCR-SSOP應用特異性寡核苷酸探針與擴增后的PCR產物雜交，適合大樣本 HLA分型初篩。但PCR-SSOP無法直接反映基因序列，在陰性和陽性磁珠上的探針熒光強度處于臨界值時可能出現誤 判 [24-27] 。 隨 著 中 華 骨 髓 庫 入 庫 標 準 逐 年 提 高 ， PCR-SSOP由于檢測的外顯子有限，出現模棱兩可的基因型較多，不能完全滿足中華骨髓庫志愿者HLA分型入庫的標準。基于3730測序儀的SBT檢測方法原始讀長可超過 1 000 bp，原始數據的準確率高達99%，是目前HLA分型的金標準[28]。商品化試劑盒HLA Ⅰ類位點一般檢測第2，3， 4外顯子，DQB1檢測第2，3外顯子，DRB1檢測第2外顯子，模棱兩可的基因型需加做其他外顯子或PCR-SSP加以鑒別。此例臨床樣本在常規PCR-SSOP分型時發現，HLA-B 存在一個假陽性的珠子，無完全匹配的結果，疑似為新基因，但無法判斷基因序列變化。應用PCR-SBT對患者 HLA-B測序，無完全匹配的基因型，與最接近的基因型 B*15:09:01，B*46:01相比，有5個堿基突變，但無法確認突變的堿基具體位于哪一條染色體。聯合NGS全長測序，證實該HLA-B*15等位基因第3、4外顯子存在5個堿基突變，內含子區域和3′UTR非翻譯區共存在13個堿基突變，從而鑒定了一個HLA-B新等位基因。NGS采用了大規模矩陣結構的微陣列分析技術，將所有短的單體型DNA片段序列與數據庫參考序列比對，通過擬合計算，拼接成完整的全長序列。該技術極大地降低了模棱兩可的可能，在臨床、骨髓庫及科研樣本HLA分型的高通量測序中具有較好的應用前景和實用價值[29-30]。
采集患者一級親屬的血樣做家系分析發現，患者新基因來源于其父親，單倍型為A*11:01-C*14:02-B*15:435- DRB1*04:04-DQB1*03:02，說明攜帶新基因的單倍型能穩定遺傳。先證者為南方漢族急性髓細胞白血病患者，女性，其父親為南方漢族健康人群。基因突變是否與疾病存在關聯性尚有待研究。作者所在實驗室已入庫的59 496人份中華骨髓庫南方漢族人群HLA分型數據中均未發現新等位基因HLA-B*15:435，推斷該基因為低頻基因。由于無法追溯，該基因的起源、多態性形成機制、單倍型是否具有緊密連鎖關系等尚且未知，有待進一步的研究。
SCISSCIAHCI
