發(fā)布時間：2021-09-30所屬分類：工程師職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 【摘要】為建立適用于檢測細(xì)菌菌環(huán)二鳥苷酸(C-di-GMP)的高效液相的方法，本文對高效液相的檢測波長、流速和流動相等檢測條件進(jìn)行研究。研究結(jié)果確定的檢測條件為：色譜柱：DiamonsilC18(2)，1504.6mm，5m;進(jìn)樣體積20L;流速0.5mL/min;檢測波長253nm;流動相A為
【摘要】為建立適用于檢測細(xì)菌菌環(huán)二鳥苷酸(C-di-GMP)的高效液相的方法，本文對高效液相的檢測波長、流速和流動相等檢測條件進(jìn)行研究。研究結(jié)果確定的檢測條件為：色譜柱：DiamonsilC18(2)，150×4.6mm，5μm;進(jìn)樣體積20μL;流速0.5mL/min;檢測波長253nm;流動相A為10mmol/L乙酸銨，流動相B為10mmol/L乙酸銨甲醇溶液，梯度洗脫。該條件下建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2為0.994，加標(biāo)回收率為88.2%~95.3%，精密度RSD為0.98%，可用于檢測細(xì)菌中環(huán)二鳥苷酸。
【關(guān)鍵詞】環(huán)二鳥苷酸;高效液相色譜;檢測方法
在很多食源性細(xì)菌中，環(huán)二鳥苷酸(C-di-GMP)細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，對C-di-GMP可能參與的細(xì)菌代謝調(diào)控包括：細(xì)胞周期、分化、變異、細(xì)胞通訊、細(xì)菌生物膜、運動、毒性等多種生命活動和代謝[1]。C-di-GMP是以一個二聚體的形式存在的，包括兩個鳥苷酸。細(xì)菌胞內(nèi)C-di-GMP主要由含GGDEF(Gly-GlyAsp)結(jié)構(gòu)域的二鳥苷酸環(huán)化酶(DGC)合成，并由含EAL(GluAla-Leu)或HD-GYP(His-Asp-Gly-Tyr-Pro)結(jié)構(gòu)域的特異性磷酸二酯酶(PDE)降解。細(xì)菌胞內(nèi)C-di-GMP濃度取決于細(xì)菌生存環(huán)境和代謝需求，但含量較低一般都在pmol級別，不容易檢測。常用的檢測研究一般都需要借助質(zhì)譜才能完成定量分析。建立適用的高效液相色譜檢驗方法對降低研究成本和提高研究效率都有重要意義。本文旨在建立細(xì)菌中C-di-GMP的高效液相檢測方法，為細(xì)菌的C-di-GMP研究提供方法參考。
1材料與方法
1.1材料和試劑
環(huán)二鳥苷酸鈉(Cyclic-di-GMPsodiumsalt)標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，HPLC)，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;乙酸銨(Ammoniumacetate，純度≥98%)，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;甲醇(HPLC)，西隴科學(xué)股份有限公司。
1.2儀器設(shè)備
全波長酶標(biāo)儀(1510)，賽默飛世爾上海儀器有限公司;高效液相色譜儀(島津LC-16)，島津企業(yè)管理(中國)有限公司;超純水機(jī)(RODI-220B1)，廈門銳思捷純水技術(shù)有限公司。
1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備
環(huán)二鳥苷酸C-di-GMP標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備：稱取1mgC-diGMP標(biāo)準(zhǔn)品，加水溶解并定容至1mL，此溶液濃度為1mg/mLCdi-GMP標(biāo)準(zhǔn)儲備液。1mLC-di-GMP標(biāo)準(zhǔn)品加水溶解并定容至10mL，此溶液濃度為0.1mg/mLC-di-GMP標(biāo)準(zhǔn)中間液。根據(jù)需要將C-di-GMP標(biāo)準(zhǔn)中間液，梯度稀釋成濃度為0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。經(jīng)0.45um濾膜過濾后備用。
1.4色譜條件和檢測方法
參考調(diào)整后的Christian等的方法[2]：色譜柱：DiamonsilC18(2)，150×4.6mm，5μm;進(jìn)樣體積20μL;流速0.5mL/min;檢測波長253nm;流動相A：10mmol/L乙酸銨，流動相B：10mmol/L乙酸銨甲醇溶液，梯度洗脫。
1.5加標(biāo)回收率實驗
根據(jù)確定的色譜條，配置不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC分析，每一個濃度進(jìn)行三次平行試驗，記錄色譜圖，測定峰面積，得到此方法的C-di-GMP加標(biāo)回收率[3]。加標(biāo)回收率(%)=(C1-C2)/M×100;公式中：C1-測得的加標(biāo)樣品中C-di-GMP的峰面積;C2-測得的空白基質(zhì)樣品中C-di-GMP的峰面積;M-稀釋的C-di-GMP的峰面積。
1.6精密度實驗
講C-di-GMP中間液稀釋成0.001mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用建立的方法進(jìn)行高效液相分析，計算出方法的精密度標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值。
2結(jié)果討論
2.1環(huán)二鳥苷酸光譜掃描分析
環(huán)二鳥苷酸鈉鹽屬于核苷酸環(huán)化后加鹽的弱酸鹽，對標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行全波長掃描發(fā)現(xiàn)，環(huán)二鳥苷酸鈉鹽的最大吸收峰的光譜波長在245nm至255nm之間。最終結(jié)合參考文獻(xiàn)選擇253nm為液相檢測波長。
2.2流速和梯度洗脫程序的確定
環(huán)二鳥苷酸鈉鹽的高效液相體系需要用鹽溶性流動相。乙酸銨屬于中性鹽溶液，是常見的用于核苷酸類鹽溶液HPLC檢測流動相。最終選擇A：10mmol/L乙酸銨、B：甲醇的10mmol/L乙酸銨溶液作為流動相，進(jìn)行流速和梯度洗脫。
2.3流速和梯度洗脫程序的確定
流動相的流速對高效液相的出峰時間和峰形都有一定影響。對比0.5mL/min和1mL/min的流速，當(dāng)流動相流速為0.5mL/min時，峰形和檢測效率均較理想。流動相的乙酸銨的濃度對環(huán)二鳥苷酸的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有一定影響，需要通過調(diào)整流動相的比例以得到合適的條件。經(jīng)調(diào)整流動相的比例和洗脫時間，進(jìn)一步確定了洗脫梯度條件見表1，在該條件下洗脫的分離效果和峰形較好。
2.4洗脫體積和回收率實驗
試驗中采用0mL、5mL、8mL、12mL、15mL洗脫液體積進(jìn)行流動相洗脫[4]，做加標(biāo)回收實驗。由實驗可知，洗脫液體積為0mL時，回收率為81.2%;5mL時，回收率為86.7%;8mL時，回收率為93.5%;12mL時，回收率為97.4%;15mL時，回收率為95.1%。顯然當(dāng)洗脫體積12mL時，已經(jīng)完全將C-di-GMP洗脫下來。從節(jié)約性考慮，該試驗方法流動相的洗脫體積選擇12mL。
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2.5色譜檢測條件和標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖
最終確定的環(huán)二鳥苷酸HPLC檢測條件為：色譜柱：Diamon⁃silC18(2)，150×4.6mm，5μm;進(jìn)樣體積20μL;流速0.5mL/min;檢測波長253nm;流動相A：10mmol/L乙酸銨，流動相B：10mmol/L乙酸銨甲醇溶液，梯度洗脫條件：0-5min：98%流動相A，2%流動相B;5-20min：90%流動相A，10%流動相B;20-25min：10%流動相A，90%流動相B。在此條件所得到的環(huán)二鳥苷酸色譜圖如圖1所示。
2.6標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍的確認(rèn)
以峰面積為縱坐標(biāo)，以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)[5]，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程如表2所示。回歸方程為y=(7×107)x-3313.3;R2=0.994。由本試驗線性相關(guān)系數(shù)(0.994)，在試驗濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。
2.7加標(biāo)回收率
將C-di-GMP標(biāo)準(zhǔn)中間液配制為0.0075mg/mL、0.0055mg/mL、0.003mg/mL的C-di-GMP標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后HPLC分析。由表3回收率可知，該方法回收率為88.2%~95.3%。本試驗在加標(biāo)濃度在0.003~0.0075mg/mL范圍內(nèi)，回收率良好。
2.8精密度
C-di-GMP中間液稀釋成0.001mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過重復(fù)進(jìn)樣進(jìn)行高效液相分析，結(jié)果如表4所示。由表4可知，該方法精密度標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.98%，這表明精密度良好。
3結(jié)論
本文對檢測細(xì)菌C-di-GMP高效液相方法的色譜條件進(jìn)行了研究。確定的色譜條件為：色譜柱：DiamonsilC18(2)，150×4.6mm，5μm;進(jìn)樣體積20μL;流速0.5mL/min;檢測波長253nm;流動相A：10mmol/L乙酸銨，流動相B：10mmol/L乙酸銨甲醇溶液，梯度洗脫。該條件下建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2為0.994，線性關(guān)系良好;加標(biāo)回收率為88.2%~95.3%，精密度RSD為0.98%，重復(fù)性良好;可用于檢測細(xì)菌中環(huán)二鳥苷酸。——論文作者：李汝鍶，衛(wèi)耀輝，劉永吉
