發(fā)布時間：2020-12-30所屬分類：工程師職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 【摘要】目的探討臨床應(yīng)用組織工程軟骨行鼻再造術(shù)的安全性及效果。方法2014年3月2015年10月，收治5例擬行全鼻再造患者。其中，1例4歲患兒為先天性鼻畸形者;其余4例成年患者為外傷所致鼻部亞單位缺損，男3例，女1例;年齡24～33歲，平均28.5歲。以鼻中隔軟骨(
【摘要】目的探討臨床應(yīng)用組織工程軟骨行鼻再造術(shù)的安全性及效果。方法2014年3月—2015年10月，收治5例擬行全鼻再造患者。其中，1例4歲患兒為先天性鼻畸形者;其余4例成年患者為外傷所致鼻部亞單位缺損，男3例，女1例;年齡24～33歲，平均28.5歲。以鼻中隔軟骨(兒童)或耳軟骨(成人)來源的種子細(xì)胞來源與聚羥基乙酸(poly-glycolicacid，PGA)-聚乳酸(poly-lacticacid，PLA)支架復(fù)合培養(yǎng)，在體外構(gòu)建組織工程軟骨。1例患兒一期行鼻部畸形矯正術(shù)、硅膠假體植入術(shù)，二期取出假體同時植入組織工程軟骨;其余4例成年患者均采用額部皮瓣擴(kuò)張法行鼻再造。鼻再造術(shù)后患者行1～4次鼻修整術(shù);術(shù)中對植入的組織工程軟骨進(jìn)行觀察，其中2例取材行組織學(xué)觀察。結(jié)果術(shù)后3例患者出現(xiàn)低熱;額部擴(kuò)張皮瓣均成活，切口均Ⅰ期愈合，無感染、明顯排斥反應(yīng)、組織工程軟骨外露等并發(fā)癥發(fā)生。額部供區(qū)切口均Ⅰ期愈合。患者均獲隨訪，隨訪時間9～74個月，平均54.8個月。隨訪期間患者鼻部無明顯不適，通氣功能良好，對鼻部外形基本滿意。組織工程軟骨組織學(xué)觀察示術(shù)后早期1例出現(xiàn)明顯鈣化，另1例有軟骨存在;術(shù)后遠(yuǎn)期1例呈纖維結(jié)締組織表現(xiàn)，另1例仍有軟骨存留。結(jié)論臨床應(yīng)用初步證明使用組織工程軟骨行鼻再造安全，但其有效性仍需進(jìn)一步驗證。
【關(guān)鍵詞】組織工程軟骨;鼻再造;鼻缺損;鼻畸形
鼻位于面部中央，外鼻缺損或畸形對人的外貌有著顯著影響。鼻再造是修復(fù)鼻缺損或矯正鼻畸形的主要方法，外被、支架和襯里是鼻再造的3個重要組成部分[1]。支架是整個再造鼻的骨架核心，是將二維皮瓣轉(zhuǎn)化為三維立體結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵。本課題組前期采用3D打印技術(shù)在體外成功構(gòu)建具有精細(xì)結(jié)構(gòu)的組織工程鼻翼軟骨[2]。為進(jìn)一步探索該組織工程軟骨用于鼻再造的安全性和有效性，2014年3月—2015年10月我們將其用于治療5例鼻缺損或畸形患者。現(xiàn)回顧5例患者治療過程，總結(jié)臨床觀察結(jié)果，為今后研究提供參考。
1臨床資料
1.1一般資料
本組1例4歲患兒為先天性鼻畸形。其余4例成年患者為外傷所致鼻部亞單位缺損，男3例、女1例;年齡24～33歲，平均28.5歲。既往均未對鼻畸形或缺損進(jìn)行修復(fù)。臨床資料詳見表1。
1.2組織工程軟骨構(gòu)建
1.2.1種子細(xì)胞培養(yǎng) 局麻下，成年患者取耳甲腔軟骨約0.12mL，兒童取鼻中隔軟骨約0.013mL，置于0～4℃培養(yǎng)液中，即刻轉(zhuǎn)送至實驗室。使用酶消化法獲得原代人耳軟骨細(xì)胞/鼻中隔軟骨細(xì)胞，用含H-DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司，美國)、5.0ng/mLbFGF(R&D公司，美國)、10%FBS(HyClone公司，美國)的完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，以1.5×104個/cm2密度接種后，置于37℃、5%CO2及100%飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長匯合至70%～80%進(jìn)行傳代，收集第2代軟骨細(xì)胞，備用。
1.2.2組織工程軟骨構(gòu)建 ①應(yīng)用3D打印技術(shù)制備與正常鼻翼、鼻背形態(tài)相似的塑料支架，利用塑料支架制備石膏陽模與陰模。
②采用聚羥基乙酸(poly-glycolicacid，PGA)-聚乳酸(poly-lacticacid，PLA)復(fù)合材料構(gòu)建組織工程軟骨支架。其中，PGA分子量約30000，由上海組織工程國家工程中心提供;PLA分子量約10000，購于美國Sigma-Aldrich公司。將無紡的絮狀PGA纖維均勻鋪在石膏陽模上，反復(fù)滴加含0.5%PLA的二氯甲烷溶液，至PLA干重占支架材料總質(zhì)量的15%;待二氯甲烷大部分揮發(fā)后，扣上陰模加壓使其成型。
③當(dāng)制備的PGA-PLA材料達(dá)所需強(qiáng)度時，取出并修剪周圍多余材料，獲得相應(yīng)形態(tài)的支架。將支架材料置于75%乙醇浸泡1h、紫外線照射30min消毒，無血清DMSM培養(yǎng)液洗滌5次，加入常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)48h，確定無污染后吸干培養(yǎng)液備用。
④取1.2.1制備的第2代軟骨細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個/mL后接種于PGA-PLA支架材料上;采用軟骨重分化培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2及100%飽和濕度條件下培養(yǎng)12周，體外構(gòu)建組織工程軟骨。培養(yǎng)結(jié)束后，將其行HE染色檢測，確定無感染后植入人體內(nèi)。其中，早期收治的例1、2組織工程軟骨制備為片狀，為進(jìn)一步縮短術(shù)中支架雕刻時間，例3、4、5將再造鼻背部分的組織工程軟骨形狀改為與隆鼻用硅膠L型支架一致。
1.3手術(shù)方法
本組1例先天性鼻畸形患兒一期行鼻部畸形矯正術(shù)、硅膠假體植入術(shù)，二期取出假體同時植入組織工程軟骨;其余4例成年患者均采用額部皮瓣擴(kuò)張法進(jìn)行鼻再造。
1.3.1一期手術(shù) 一期行額部擴(kuò)張器植入。全麻下，標(biāo)記發(fā)際內(nèi)切口線及擴(kuò)張器置入范圍。切開皮膚，在皮下層進(jìn)行剝離，在帽狀腱膜下層分離至預(yù)定范圍。4例成年患者均置入300mL橢圓形擴(kuò)張器，留置引流管1根，適當(dāng)加壓包扎。本組例4同時行鼻孔開大術(shù)。
術(shù)后14d切口愈合后拆線。拆線后1周開始向擴(kuò)張器內(nèi)注水，每周注水2次，每次注水15～20mL，待總注水量達(dá)600～750mL后停止注水并靜置1個月。注水及靜置共耗時5～6個月，平均5.75個月。
1.3.2二期手術(shù)
二期行全鼻再造。全麻下，于鼻部受區(qū)切開松解瘢痕，依據(jù)局部瘢痕及黏膜情況制作襯里皮瓣，于鼻背正中皮下徹底松解組織，并于骨膜上方剝離形成腔隙。然后取出擴(kuò)張器，設(shè)計額部帶蒂皮瓣。局麻后，切開皮瓣按照蒂部扭轉(zhuǎn)方位向下旋轉(zhuǎn)皮瓣至受區(qū)。將構(gòu)建的組織工程軟骨適當(dāng)修剪，分別置于鼻翼及鼻背，并與周圍組織固定。將皮瓣與制備的襯里皮瓣縫合，縫合額部供區(qū)。
術(shù)后放置引流管，密切觀察皮瓣血運(yùn)及引流情況，2d后拔出引流管，14d后拆線。術(shù)后1個月開始使用腸鉗夾持再造鼻蒂部血運(yùn)進(jìn)行鍛煉，待血運(yùn)阻斷可達(dá)2h以上時，行三期皮瓣斷蒂術(shù)。
1.3.3三期手術(shù)
三期行皮瓣斷蒂術(shù)。全麻后，患者取平臥位，采用局部浸潤麻醉后切斷鼻根蒂部，舒展皮瓣，形成鼻根，并將多余的蒂部組織剖開形成皮瓣，與額部受區(qū)分層縫合。斷蒂后6個月左右水腫消退、皮瓣收縮和瘢痕穩(wěn)定后[3]，根據(jù)患者鼻部外形行再造鼻修整術(shù)，包括修薄皮瓣形成鼻部精細(xì)結(jié)構(gòu)、調(diào)整軟骨支架、修復(fù)切口瘢痕等。本組5例患者行1～4次鼻修整術(shù)，平均2.2次。
1.4組織學(xué)觀察本組
2例患者鼻修整術(shù)中取組織工程軟骨進(jìn)行組織學(xué)觀察，其中例3分別于術(shù)后1年半、5年取材，例4分別于術(shù)后4年、5年進(jìn)行取材。上述標(biāo)本均行HE染色、EvG彈性纖維染色以及Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色。為方便表述，以術(shù)后早期(植入時間<2年)和遠(yuǎn)期(植入時間>2年)來區(qū)分。
2結(jié)果
2.1臨床觀察結(jié)果
4例成年患者二期術(shù)后72h內(nèi)皮瓣遠(yuǎn)端均未出現(xiàn)靜脈淤血現(xiàn)象，皮瓣均全部成活，切口Ⅰ期愈合，無急性期感染、明顯排斥反應(yīng)等并發(fā)癥發(fā)生。額部供區(qū)切口均Ⅰ期愈合。4例成年患者中，2例患者(例3、例4)術(shù)后出現(xiàn)一過性低熱，未予特殊處理，自行緩解;2例患者(例1、例2)鼻部腫脹程度較其余2例明顯，經(jīng)常規(guī)口服消腫藥物處理后，切口均按時拆線。另1例患兒(例5)二期組織工程軟骨植入術(shù)后出現(xiàn)持續(xù)性低熱，鼻部腫脹明顯，術(shù)后2d拔出引流管后引流管口延遲愈合，滲出液較多，取分泌物細(xì)菌培養(yǎng)陰性;6d時體溫突然升高，考慮為扁桃體炎，對癥予抗生素治療后體溫恢復(fù)正常，切口按時拆線。
術(shù)后5例患者均獲隨訪，隨訪時間9～74個月，平均54.8個月。隨訪期間患者鼻部無明顯不適，無組織工程軟骨感染、移位或變形等并發(fā)癥發(fā)生，鼻部形態(tài)明顯改善，皮瓣色澤與正常皮膚相似，質(zhì)地柔軟，鼻部無明顯通氣障礙。患者對鼻部外形基本滿意。見圖1、2。
2.2組織學(xué)檢測結(jié)果
鏡下觀察：術(shù)后早期(例3)取材HE染色可見散在的軟骨組織結(jié)構(gòu)，EvG彈性纖維染色陽性，Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色陽性，Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色為弱陽性。其余大部分與纖維結(jié)締組織表現(xiàn)相同，可見散在的無結(jié)構(gòu)組織，旁邊可見多核巨噬細(xì)胞浸潤，考慮為PGA-PLA殘余支架成分。術(shù)后遠(yuǎn)期取材中，例3患者HE染色呈纖維結(jié)締組織特點，未見明顯軟骨組織結(jié)構(gòu)，EvG彈性纖維染色呈陰性，Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色呈強(qiáng)陽性，Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色呈陰性，同樣可見散在的無結(jié)構(gòu)組織。例4患者取材中，1個標(biāo)本呈明顯骨化表現(xiàn)，另1個標(biāo)本中可見明顯軟骨組織結(jié)構(gòu)，HE染色、EvG彈性纖維染色以及Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色結(jié)果則與例3術(shù)后早期結(jié)果相似。見圖3。
3討論
理想化的鼻部組織工程軟骨是能在減少患者損傷的同時，提供更好的支架材料，降低手術(shù)難度，減少手術(shù)時間和鼻修整次數(shù)。Fulco等[4]首次在癌癥術(shù)后患者中使用片狀組織工程軟骨進(jìn)行單側(cè)鼻翼重建，獲得了較好的鼻翼功能與外形重建。除此之外，其他用于鼻部的組織工程軟骨人體體內(nèi)研究非常有限[5]。
在我們臨床試驗中，經(jīng)過5年的術(shù)后隨訪，已初步證實了自體耳軟骨細(xì)胞或鼻中隔軟骨細(xì)胞復(fù)合PGA-PLA支架體外構(gòu)建的組織工程軟骨在鼻再造中的安全性。在3D打印技術(shù)輔助下，可以近乎精確地獲得鼻翼和鼻背形狀的組織工程軟骨，但是隨訪發(fā)現(xiàn)植入后仍存在一些問題。組織學(xué)檢測顯示，組織工程軟骨在植入鼻部后，軟骨組織逐漸被吸收，取而代之的是纖維結(jié)締組織，有少量的PGA-PLA支架材料殘留。例4患者組織工程軟骨植入體內(nèi)8個月后就出現(xiàn)了明顯的鈣化現(xiàn)象[6]，但具體原因尚不知曉。在本課題組同期進(jìn)行的組織工程軟骨耳廓再造臨床試驗中，結(jié)果顯示軟骨支架移植入體內(nèi)最早2個月就開始出現(xiàn)變形、坍塌，解剖結(jié)構(gòu)模糊，MRI也顯示植入的軟骨被吸收[7-8]。盡管植入的組織工程軟骨外形和力學(xué)性能尚可滿足臨床需求，但植入體內(nèi)后出現(xiàn)的這種吸收、纖維化及鈣化趨勢，必然會導(dǎo)致不可預(yù)測的剛度變化及原位變形，并最終對頭面部再造器官的外形產(chǎn)生影響。已有研究證實軟骨微環(huán)境及種子細(xì)胞來源均對再生軟骨類型有一定調(diào)控作用[9]，肋軟骨來源種子細(xì)胞構(gòu)建的組織工程軟骨會表現(xiàn)出肋軟骨的骨化傾向[10]。但是，目前對于維持組織工程軟骨機(jī)變性的特異性生化成分尚不清楚，細(xì)胞生化、免疫學(xué)以及生物力學(xué)間的復(fù)雜關(guān)系也需進(jìn)一步研究。
例5患兒在組織工程軟骨植入后出現(xiàn)低熱、鼻部腫脹、滲出液增多等情況，但分泌物細(xì)菌培養(yǎng)為陰性，因組織工程軟骨的種子細(xì)胞為自體來源，所以考慮無菌性炎癥可能是由支架材料的體內(nèi)代謝或其他相關(guān)因素引起的。本試驗中采用PGA和PLA作為支架材料，其在降解過程中產(chǎn)生的低pH環(huán)境會影響軟骨細(xì)胞的生長、增殖和表型的維持，甚至導(dǎo)致細(xì)胞壞死[11]。在軟骨構(gòu)建過程，只有細(xì)胞材料復(fù)合物體外培養(yǎng)階段，PGA-PLA支架未能充分降解，且該材料在人體內(nèi)降解速度極為緩慢，即使在術(shù)后5年，構(gòu)建的組織工程軟骨中仍存在散在的支架材料未被降解。
與傳統(tǒng)的肋軟骨鼻再造法相比，采用組織工程軟骨行鼻再造降低了受區(qū)損傷，同時因為避免了繁瑣的肋軟骨支架搭建，大大縮短手術(shù)時間，根據(jù)目前患者隨訪情況，遠(yuǎn)期手術(shù)效果與肋軟骨支架鼻再造法無明顯差異。但組織工程軟骨構(gòu)建較繁瑣、價格昂貴，其在鼻再造中的應(yīng)用仍處于探索階段，距臨床推廣應(yīng)用仍有一定差距。
要實現(xiàn)組織工程軟骨在頭面部器官重建中的大規(guī)模臨床應(yīng)用，需要解決更多問題。例如，如何解決組織工程軟骨纖維化及骨化、如何將可能引發(fā)的免疫反應(yīng)和炎癥控制在最小。針對以上問題，我們依據(jù)組織工程三要素總結(jié)了可能的解決措施。①種子細(xì)胞。除成體軟骨細(xì)胞外，BMSCs和脂肪MSCs也具有成軟骨能力，它們是目前種子細(xì)胞的研究熱點。有必要對MSCs分化調(diào)控及遠(yuǎn)期轉(zhuǎn)歸進(jìn)行研究，以避免可能存在的風(fēng)險[5]。②支架材料。為避免上述支架材料植入體內(nèi)后的不良反應(yīng)可不使用支架，采用細(xì)胞膜片技術(shù)[12]進(jìn)行組織工程軟骨的培養(yǎng);或不植入支架，即加快支架材料在體外培養(yǎng)階段的代謝速率;或者探索其他新的支架材料。通過不同方式提高天然材料的可塑性及力學(xué)強(qiáng)度，或?qū)⑻烊徊牧虾腿斯ず铣刹牧线M(jìn)行復(fù)合，從而獲得組織相容性較好、形態(tài)可控、力學(xué)性能合適的復(fù)合材料[13]，如聚乳酸-羥基乙酸共聚物/脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)支架材料、殼聚糖/絲素蛋白/納米羥基磷灰石多層支架復(fù)合體[14]等，但這些支架材料在人體內(nèi)的長期安全性及用于頭面部器官重建的有效性尚不明確。③培養(yǎng)條件。動態(tài)培養(yǎng)環(huán)境比靜態(tài)培養(yǎng)環(huán)境能更好地模擬人體內(nèi)狀態(tài)，動態(tài)生物反應(yīng)器因而也更適宜組織工程軟骨組織的生長。不同的種子細(xì)胞來源及所構(gòu)建的軟骨用途不同，所適宜的最佳動態(tài)軟骨培養(yǎng)條件也存在差異[15]。本課題組自主研發(fā)了一種組合式組織工程動態(tài)培養(yǎng)儀[16]，但構(gòu)建鼻部組織工程軟骨的具體條件仍在進(jìn)一步探索。
綜上述，盡管已經(jīng)初步證實了組織工程軟骨行鼻再造術(shù)的安全性，但其有效性仍需進(jìn)一步驗證。為確保組織工程軟骨在長期植入體內(nèi)后仍能有足夠的軟骨存留，提高體外構(gòu)建軟骨的質(zhì)量及功能是后續(xù)研究的重要方向。——論文作者：任朋潔，徐奕昊，范飛，田樂，陸曉娜，尤建軍，王歡，鄭若冰
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