發(fā)布時(shí)間：2022-01-19所屬分類：農(nóng)業(yè)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：解磷微生物能夠活化土壤中的難溶性磷，篩選杉木(Cunninghamialanceolata)根際高效解磷菌對(duì)于緩解南方紅壤區(qū)杉木人工林土壤的磷素受限問題具有重要現(xiàn)實(shí)意義.以南方紅壤區(qū)不同林齡(2，4，10，15a)杉木人工林下的根際土壤為研究對(duì)象，通過平板分離初篩菌株、液體發(fā)
摘要：解磷微生物能夠活化土壤中的難溶性磷，篩選杉木(Cunninghamialanceolata)根際高效解磷菌對(duì)于緩解南方紅壤區(qū)杉木人工林土壤的磷素受限問題具有重要現(xiàn)實(shí)意義.以南方紅壤區(qū)不同林齡(2，4，10，15a)杉木人工林下的根際土壤為研究對(duì)象，通過平板分離初篩菌株、液體發(fā)酵復(fù)篩菌株和16SrDNA 測(cè)序，篩選、鑒定高效根際解磷菌，采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定高效解磷菌的最優(yōu)培養(yǎng)條件.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：1)15a杉木根際土壤的解無機(jī)磷菌與解有機(jī)磷菌數(shù)量分別為3.64×105和2.14×105cfu/g，均顯著高于其他林齡(p<0.05)，且各林齡解磷菌類型間存在顯著差異(p<0.05);2)篩選出25株解無機(jī)磷菌和20株解有機(jī)磷菌，經(jīng)平板初篩、液體發(fā)酵復(fù)篩和16SrDNA 測(cè)序鑒定，分別得到一株解磷效果顯著(p<0.05)的解無機(jī)磷菌株 W1(溶磷量238.08μg/mL，不動(dòng)桿菌屬(Acinetobactersp.))和解有機(jī)磷菌株 Y9(溶磷量15.04μg/mL，克雷伯氏菌屬(Klebsiellasp.));3)優(yōu)化后 W1的最佳培養(yǎng)條件為1.0%(質(zhì) 量 分 數(shù))葡 萄糖、1.50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))酵母粉、初始pH7.5、裝液量30mL、接 種 量3%(體 積 分 數(shù))、溫 度40 ℃，Y9的最佳培養(yǎng)條件為0.5% 葡萄糖、1.25%酵母粉、初始pH6.0、裝液量20mL、接種量9%、溫度28℃.上述結(jié)果可為杉木根際解磷微生物的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持.
關(guān)鍵詞：杉木;解磷菌;篩選;鑒定;培養(yǎng)條件優(yōu)化;紅壤區(qū);中國南方
磷是植物生長發(fā)育、結(jié)構(gòu)組成和生理生化過程的關(guān)鍵元素之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上常通過大量施用磷肥來滿足作物對(duì)磷元素的需求，但磷肥極易與金屬離子形成不溶性磷酸鹽進(jìn)而對(duì)磷素起到固定作用[1]，這極大限制了肥料的利用效率[2-3].因此，如何活化土壤中難溶態(tài)磷并提 高 其 轉(zhuǎn) 化 利 用 效 率 成 為 當(dāng) 前 土 壤 化 學(xué) 的研究熱點(diǎn)之一[4].
我國南方林區(qū)土壤的有效磷含量極低[5]，95%～99%的磷以難溶態(tài)存在[6]，嚴(yán)重制約著南方重要用材樹種杉 木(Cunninghamialanceolata)人 工 林 的 可 持續(xù)經(jīng)營[7-9].針對(duì)杉木人工林經(jīng)營中面臨的低磷脅迫，諸多學(xué)者從施肥[10]、樹種共生[11]、硅肥配施[12]等方面做了 大 量 有 益 嘗 試，雖 取 得 了 一 些 成 效，但 依 舊 無 法有效、低成本地改善杉木人工林下土壤速效磷短缺的情況.針對(duì)南方林區(qū)杉木林地的磷素受限問題，如 何有效提升杉木對(duì)磷的利用效率，對(duì)杉木人工林的可持續(xù)經(jīng)營具有重要的現(xiàn)實(shí)意義.
活躍在植物-土壤接觸面上的微生物群落對(duì)于維持植物生長發(fā)育和植物健康起著重要作用[13].現(xiàn)有研究認(rèn)為根際微生物是農(nóng)作物根際的核心，在改善土壤理化性質(zhì)方面發(fā)揮了極大的作用[14-16].利用根際微生物改善林木對(duì)營養(yǎng)元素的吸收狀況已有諸多嘗試，前期研究從 紅 樹 林(mangrove)[17]、巨 尾 桉(Eucalyptusgrandis)[18]、馬 尾 松 (Pinusmassoniana)[19]、楓 香(Liquidambarformosana)[20]、降 香 黃 檀 (Dalbergiaodorifera)[21]等植 物 根 際 篩 選 出 了 一 批 具 有 顯 著 解磷效果的根際微生物[22-23]，這為提升杉木在困難立地條件下的養(yǎng)分吸收效率提供了新思路.吳則焰等[24]提出杉木連栽導(dǎo)致土壤養(yǎng)分逐代降低，進(jìn)而表現(xiàn)為不同林齡杉木的根際微生物群落存在較大差異.杉木根際磷素含量隨著林齡的增加而降低[25]，中幼齡杉木人工林下的土壤微生物數(shù)量顯著高于其他林齡[26]，且中幼林對(duì) 養(yǎng) 分 需 求 量 大.因 此，本研究以不同林齡杉木 人工林 為 研 究 對(duì) 象，以 杉 木 根 際 土 壤 為 供 試 土 壤，通 過平板定性與搖瓶定量篩選出高效解磷菌，鑒定高效解磷菌 株 類 型.在 此 基 礎(chǔ) 上，通過單因素實(shí)驗(yàn)與正交 試驗(yàn)優(yōu)化高效解磷菌生長條件，以期獲得具有較高解磷能力和生長量的菌株，為利用根際微生物提升杉木人工林對(duì)根際無效磷的吸收利用效率奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，亦可探索利用 解 磷 菌 改 善 杉 木 人 工 林 地 力 衰 退 問 題 的可行性.
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
供試土壤樣品采集于福建省南平市建陽區(qū)溪東國有林場(chǎng)(118°08′～120°31′E，26°40′～27°20′N)，地處武 夷 山 脈 南 側(cè)，屬 于 典 型 的 中 亞 熱 帶 季 風(fēng) 氣 候，冬溫夏熱，四季分明，季風(fēng)發(fā)達(dá)，年均降水量1700mm，年蒸發(fā)量1500mm，年均溫大于18℃，十分有利于杉木的 生 長 發(fā) 育.林 場(chǎng) 前 身 為 低 產(chǎn) 低 效 馬 尾 松 人 工 林，2008—2010年逐年砍伐后營造杉桐混交林[27]，林 下植被 種 類 主 要 有 苦 竹 (Pleioblastusamarus)、芒 萁(Dicranopterisdichotoma)、觀 音 座 蓮(Strobilanthescyclus)、黃瑞木(Adinandramillettii)等.
1.1.1 土壤樣品采集及理化性質(zhì)測(cè)定
本實(shí)驗(yàn)選取中幼林齡(2，4，10，15a)杉木人工林，各取3塊具有代表 性 的20m×20m 樣 地，每 塊 樣 地采用五點(diǎn)取樣法，鏟去表土后深挖10～20cm，選取具有完 整 根 系 的 土 體，采用抖落法采集根際土壤，同 一樣地各取樣點(diǎn)土壤均勻混合并標(biāo)號(hào)處理，同時(shí)采集非根際土壤進(jìn)行標(biāo)號(hào)處理，將土樣裝入冰盒帶回至冰箱(4 ℃)保存.其中新鮮根際土樣用于菌株篩選，非根際土樣待風(fēng)干過篩后進(jìn)行理化性質(zhì)測(cè) 定(表1)，土 壤 類型均 為 紅 壤，其他理化性質(zhì)采取常規(guī)測(cè)定方式：全 磷測(cè)定采用鉬銻抗比色法，有效磷測(cè)定采用鹽酸-硫酸浸提法，有機(jī)質(zhì)測(cè)定采用重鉻酸 鉀-外 加 熱 法，全 氮 測(cè) 定采用半微量凱氏法，水解氮測(cè) 定 采 用 堿 解-擴(kuò) 散 法，全鉀測(cè)定采用堿熔-火焰光度法，速效鉀測(cè)定采用乙酸銨浸提-火焰光度法，pH 測(cè)定采用電位法[28].
1.1.2 培養(yǎng)基
李豆豆等[29]指出以磷酸三鈣為磷源時(shí)，菌株解磷量顯著高于其他磷源類型，因此采用磷酸三鈣無機(jī)磷培養(yǎng)基(葡萄糖10.0g，硫酸銨0.5g，硫酸鎂0.3g，氯化鈉0.3g，氯化鉀0.3g，硫酸亞鐵0.03g，硫酸錳0.03g，磷酸三鈣5.0g，瓊脂18.0g，蒸餾水1L，pH7.0～7.5)來 分 離 解 無 機(jī) 磷 菌 株.采用蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基(葡萄糖10.0g，硫酸銨0.5g，硫酸鎂0.3g，氯化鈉0.3g，氯化鉀0.3g，硫酸亞鐵0.03g，硫酸錳0.03g，卵磷脂0.2g，碳酸鈣5.0g，瓊脂18.0g，蒸餾水1L，pH7.0～7.5)來分離解有機(jī)磷菌株[30].發(fā) 酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基選用 LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10.0g，酵母浸出粉5.0g，氯化鈉0.5g，pH7.0～7.2)[31].
1.2 解磷菌的篩選、鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化
1.2.1 解磷菌分離與純化
取搖床震 蕩 后 的 土 壤 溶 液 上 清 液 成 倍 數(shù)(10-3，10-4，10-5)稀釋，涂于磷酸三鈣無機(jī)磷培養(yǎng)基和蒙金娜有機(jī) 磷 平 板 培 養(yǎng) 基 上，每 個(gè) 梯 度 設(shè) 置3組 重 復(fù)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng) 箱 中(解 有 機(jī) 磷 菌 培 養(yǎng)3d，解 無 機(jī)磷菌培養(yǎng)7d)[32-33]，記 錄 含 溶 磷 圈 菌 落 數(shù).菌 落 的 純化采用劃線法并培養(yǎng)3～7d，純化后將單菌落轉(zhuǎn)移至牛 肉 膏 蛋 白 胨 斜 面 培 養(yǎng) 基 上，保 存 于 4 ℃ 冰 箱備用[34].
1.2.2 解磷菌篩選
解磷菌篩選采用平板初篩與搖瓶復(fù)篩.平板初篩需記錄各菌株的溶磷圈直徑、菌 落 直 徑 及 二 者 比 值，各菌株 設(shè)5組 重 復(fù)，取 平 均 值.搖 瓶 復(fù) 篩 需 將 初 篩 得到的菌株接種到液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)7d(28 ℃，160r/min)，對(duì) 培 養(yǎng) 好 的 菌 株 進(jìn) 行 離 心 處 理 (4 ℃，10000r/min，10 min)，利用鉬銻抗比色法檢測(cè)上清液中的溶磷量，判斷各菌株的溶磷能力.
1.2.3 16SrDNA 測(cè)序鑒定
利用16SrDNA 通用引物序列 F27和 R1492對(duì)篩選得到的細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增，純化后送往上海邁浦生物科技有限公司進(jìn) 行測(cè)序，將 測(cè) 序 結(jié) 果 提 交 至 RDP(http：∥rdp.cme.msu.edu/)及 NCBI(http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù) 據(jù) 庫 中 進(jìn) 行 序 列 比 對(duì) 分 析，選取與 GenBank中同源性最高的序列，初步鑒定菌株.
1.2.4 培養(yǎng)優(yōu)化
培養(yǎng)基組分 優(yōu) 化：采 用 不 同 碳 源(葡 萄 糖、蔗 糖、乳糖、可 溶 性 淀 粉、麥 芽 糖、甘 露 醇)代 替 基 礎(chǔ) 培 養(yǎng) 基中的碳源，根據(jù)菌液在600nm 下的吸光度(A600)確定最佳 碳 源.改 變 最 佳 碳 源 質(zhì) 量 分 數(shù) (0.5%，1.0%，1.5%)進(jìn)行菌株培養(yǎng)以確定最佳濃度.最 佳 氮 源(硫酸銨、氯 化 銨、硝 酸 鉀、蛋 白 胨、酵 母 粉、尿 素)及 其 最適質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.5%，0.8%，1.0%，1.3%，1.5%)的確定采取相同方式.
培養(yǎng)條件優(yōu) 化：在其他條件不變的情況，分 別 改變菌株 發(fā) 酵 液 的 pH(5.0，6.0，6.5，7.0，7.2，7.5，8.0，9.0)、裝液量(10，20，30，40，60mL，于100mL發(fā)酵瓶)、接 種 量 (1%，3%，5%，7%，9%，均 為 體 積 分?jǐn)?shù))、培養(yǎng)溫度(20，25，28，30，35，40 ℃)，測(cè) 量 對(duì) 應(yīng) 的A600，確定對(duì)應(yīng)的最適值.
正交試驗(yàn)：根 據(jù) 單 因 素 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果，設(shè) 計(jì) 四 因 素 三水平正交試驗(yàn)，基于初始pH 值(A)、裝液量(B)、接種量(C)、培養(yǎng)溫度(D)以及不同水平的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù).
1.3 數(shù)據(jù)處理
采用 Exce12010軟件進(jìn)行原始數(shù)據(jù)的整理、分析及圖像繪制，運(yùn)用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(顯著水平0.05)和 最 小 顯 著 差 數(shù)(LSD)法 多 重 比較，采用 Pearson相關(guān)系數(shù)法確定 pH 與 溶 磷 量 之 間的相關(guān)關(guān)系，運(yùn) 用 正 交 設(shè) 計(jì) 助 手Ⅱ v3.1處 理 正 交 試驗(yàn)數(shù)據(jù).
2 結(jié)果與分析
2.1 解磷菌的篩選結(jié)果
對(duì)分離出的菌落進(jìn)行形態(tài)特征判斷，經(jīng)福建省林業(yè)科學(xué)研究院形態(tài)學(xué)鑒定分析其培養(yǎng)形態(tài)，發(fā)現(xiàn)4種不同林齡的杉木根際土壤解磷菌形態(tài)各異.所篩選出的解磷菌以不透明的白色、乳白色、淺黃色為主，菌落呈圓形、不規(guī) 則 形，邊 緣 基 本 整 齊，中 間 以 凸 起 為 主，菌株 表 面 大 多 光 滑.不同菌株的生長速度不一致，絕大多數(shù)菌株的生長速度較快，可在24h內(nèi)生長為菌落成型;但亦存在解磷真菌在48h后才長勢(shì)較好，生長速度較緩慢.
不同林齡杉木根際解磷菌數(shù)量及種類亦存在差異(表2).從數(shù)量來看，杉木人工林下根際解無機(jī)磷菌的數(shù)量范圍為2.12×105～3.64×105cfu/g(cfu為菌落形成單位)，解有機(jī)磷菌的數(shù)量范圍為1.31×105～2.14×105cfu/g.其中，15a杉木根際土壤的解無機(jī)磷菌數(shù)量和解有機(jī)磷菌數(shù)量均顯著高于其他林齡(p<0.05)，且 類 型 數(shù) 最 多，而解有機(jī)磷菌類型數(shù)為 9，與4a杉木的類型數(shù)相同.
從以上 解 磷 菌 中 挑 選 解 磷 效 果 具 有 顯 著 優(yōu) 勢(shì) 的菌株進(jìn)行溶磷實(shí)驗(yàn)，對(duì)高效解磷菌進(jìn)行16SrDNA 測(cè)序鑒 定.通 過 對(duì) 杉 木 根 際 解 磷 菌 進(jìn) 行 平 板 初 篩，無 機(jī)磷培養(yǎng)基和有機(jī)磷培養(yǎng)基中均出現(xiàn)較明顯的透明圈，表明根際解 磷 微 生 物 能 夠 溶 解 無 機(jī) 磷 和 有 機(jī) 磷 并 轉(zhuǎn)化至可被植物或自身吸收利用的有效磷素.本研究共篩選得到具有較明顯作用的25株解無機(jī)磷菌株和20株解 有 機(jī) 磷 菌 株.對(duì) 以 上 菌 株 進(jìn) 行 搖 瓶 復(fù) 篩 后 發(fā) 現(xiàn)，在固體培養(yǎng) 基 中 溶 磷 圈 直 徑 與 菌 落 直 徑 比 值 大 的 菌株，在液體培養(yǎng)基中的解磷能力并不一定顯著突出，這與黃鵬飛等[35]關(guān)于解磷菌在固體平板和液體培養(yǎng)兩種方式下 的 解 磷 效 果 并 不 存 在 線 性 關(guān) 系 的 研 究 結(jié)果一致.圖中數(shù)據(jù)字母不同表示差異顯著(p<0.05)，下同.圖2 解無機(jī)磷菌株的溶磷量Fig.2 Phosphorussolubilizingcapacityofinorganicphosphorus-solubilizingstrain
解磷菌常通過分泌有機(jī)酸來溶解難溶性磷，發(fā)酵液的pH 降 低，從 側(cè) 面 可 反 映 出 菌 株 溶 磷 能 力 的 高低[36-37].本研究 在 探 究 解 無 機(jī) 磷 菌 株 的 溶 磷 能 力 時(shí)，對(duì)菌株培養(yǎng)液的pH 進(jìn)行測(cè)定，所測(cè)值均低于對(duì)照組，這一結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)論.發(fā)酵液 的無機(jī)磷溶解量與pH 呈極顯著負(fù)相關(guān)性(p<0.01，R2=0.7497，r=-0.8659)，解磷能力強(qiáng)的菌株培養(yǎng) 液 pH 較 低，反之pH 較高，只有個(gè)別菌株呈現(xiàn)差異(圖1).有機(jī)磷溶解量 與 pH 的 相 關(guān) 關(guān) 系 并 不 顯 著(p>0.05)，解 有機(jī)磷菌株的溶液pH 主要集中于6.58～7.42之間，僅菌株 Y3溶液的pH 為1.89，呈現(xiàn)出強(qiáng)酸性，與其他菌株差異較大，究其原因，可能是由于大部分解磷菌以酶解為主[38]，而 Y3以分泌有機(jī)酸來發(fā)揮溶磷作用[39-40].
通過復(fù)篩，采用單因素方差分析各菌株的無機(jī)磷溶解量.無 機(jī) 磷 溶 解 量 較 空 白 對(duì) 照 組(CK)均 有 增 加(圖2)，增量范圍為4.01～235.88μg/mL，溶 磷 量 范圍為6.31～238.08μg/mL.W1的解磷效果顯著高于其他菌株(p<0.05)，溶磷量達(dá)238.08μg/mL;溶 解無機(jī)磷效果最差的是 W15，溶磷量僅為6.31μg/mL.W1溶磷量是 W15溶磷量的37.73倍.
有機(jī)磷溶解量較空白對(duì)照組均有增加(圖3)，增量范圍為1.07～11.33μg/mL，溶磷量范圍為4.78～15.04μg/mL.Y9的解磷效果顯著高于其他菌株(p<0.05)，溶 磷 量 達(dá) 15.04μg/mL;解磷效果最差的是Y10，溶磷量 僅 為4.78μg/mL.Y9溶 磷 量 為 Y10溶磷量的3.15倍.
2.2 菌株鑒定結(jié)果
經(jīng) PCR 擴(kuò) 增 后 的 16SrDNA 基 因 序 列 (附 錄(http：∥jxmu.xmu.edu.cn/upload/html/20220115.html)圖S1和 S2)通 過 核 酸 BLAST 序 列 比 對(duì) 后，得到相似菌株的登錄號(hào)與相似度.經(jīng)鑒定，W1為不動(dòng)桿菌屬(Acinetobactersp.，登錄號(hào) MZ145066.1)(圖4)，Y9為克雷伯氏菌屬(Klebsiellasp.，登錄號(hào) MZ145064.1)(圖5).
2.3 解磷菌培養(yǎng)條件優(yōu)化
綜合上 述 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果，選 用 解 無 機(jī) 磷 效 果 最 好 的W1與解有機(jī)磷效果最好的 Y9進(jìn)行培養(yǎng)基組分優(yōu)化和培養(yǎng)條件優(yōu)化.圖5 菌株 Y9的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 PhylogenetictreeofstrainY9
2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)篩選
菌株生長量對(duì)于不同碳源、氮 源、初 始 pH、裝 液量、接種量、溫度的響應(yīng)有顯著差異(圖6).碳源是微生物進(jìn)行新陳代謝等活動(dòng)的主要能量來源[41].6種不 同 碳 源(葡 萄 糖、蔗 糖、麥 芽 糖、乳 糖、甘露醇和可溶 性 淀 粉)對(duì) W1和 Y9的 生 長 量 的 影 響差異顯著，W1和 Y9以葡萄糖為碳源時(shí)的A600值均顯著高于其他碳源時(shí)，菌株生長效果最好(圖6(a))，其次為甘露醇、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、蔗糖.故改變最適碳源葡萄糖的質(zhì)量分 數(shù)(圖6(b))，W1在1.0%時(shí)生長量顯著大于其他質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)，而 Y9在0.5%時(shí)生長量最大.
氮源也是微生物生長發(fā)育的重要元素之一.當(dāng)以酵母粉為唯一氮源時(shí)，W1和 Y9的生長量顯著大于其他氮源時(shí)(圖6(c))，其 次 為 蛋 白 胨，且 酵 母 粉 和 蛋 白胨對(duì)菌株生長量的影響顯著大于其他4種氮源.故設(shè)置含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)酵母粉的培養(yǎng)基，結(jié)果表明 W1在1.50% 時(shí)生長量顯著大于其他處理，而 Y9在1.25%時(shí)生長量最 大(圖 6(d))，且 質(zhì) 量 分 數(shù) 升 高 時(shí) 菌 株 的A600值變化差異 并 不 明 顯，表 明 該 菌 株 對(duì) 高 濃 度 酵 母粉氮源變化并不敏感.
pH8.0 處 理 下 W1 生 長 量 最 大，但 pH 7.0 和7.5處理下差異 性 并 不 顯 著，故后續(xù)正交試驗(yàn)采取上述3種初始pH 處理;而 Y9生長量主要在pH5.0～6.0之間呈上 升 趨 勢(shì)，后 續(xù) A600值 隨 著 pH 增 加 而 降低(圖6(e)).不 同 裝 液 量 下，菌 株 生 長 量 顯 著 不 同，W1與 Y9的最適裝液量均為30mL(圖6(f)).不同接種量下，3%，5%，7%接種量的 W1菌液A600值差異不顯著，而 Y9在9%接 種 量 時(shí) 生 長 量 顯 著 大 于 其 他 處理.溫度過高或過低也不利于菌株的生 長，35 ℃處 理下 W1生長量顯著大于其他處理，而 Y9生長量在28，30和35 ℃處理下的差異不顯著，因此設(shè)計(jì)正 交 試 驗(yàn)進(jìn)一步確定最適溫度.
2.3.2 正交試驗(yàn)
設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，選擇4個(gè)因素(初始 pH 值、裝液量、接種量和溫 度)及 每 個(gè) 因 素 設(shè) 定3個(gè) 水 平.W1的因素 A 為初始pH 值(7.0，7.5和8.0)，因素 B 為裝液量(20，30和40mL)，因素 C 為接種量(3%，5%和7%)、因素 D 為 溫 度(30，35和40 ℃).其 中，因 素 A對(duì) W1生長量影響最大，因素C和 D次之，W1的最佳培養(yǎng)條件為A2B2C1D3，即初始pH7.5、裝液量30mL、接種量3%、溫度40 ℃(表3).
Y9的因素 A 為初始pH 值(5.0，6.0和6.5)，因素 B為裝 液 量 (20，30 和 40 mL)，因 素 C 為 接 種 量(5%，7%和9%)、因素 D 為溫度(28，30和35 ℃).由于RD>RB>RC >RA，4個(gè)因素對(duì)菌株生長的影響程度為溫度>裝液量>接種量>初始pH，則 Y9的最佳培 養(yǎng) 條 件 為 A2B1C3D1，即 初 始 pH 為6.0、裝 液 量20mL、接種量9%、溫度28 ℃(表4).
正交試驗(yàn)結(jié)果與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異，表明各因素之間存在交互作用，而正交試驗(yàn)結(jié)果更具備準(zhǔn)確性.
3 討論與結(jié)論
逆境情況下，植物受環(huán)境影響會(huì)激發(fā)自身的應(yīng)激性.鄒顯花等[42]提出杉木根系通過大量增生來應(yīng)對(duì)低磷脅 迫，加快向地生長以應(yīng)對(duì)高磷環(huán)境.當(dāng) 土 壤 有 效磷含量豐富時(shí)，林木通過自身調(diào)節(jié)便可獲取足夠的營養(yǎng)元素，但處于低磷脅迫條件下的林木除自身的應(yīng)激性外，還需要解磷微生物來推動(dòng)土壤中無效磷元素的轉(zhuǎn)化以保證供給.
南方地區(qū)杉木人工林下土壤有效磷在固定作用的影響下含量降低，根際解磷微生物的應(yīng)用能夠有效緩解低磷壓力[43].本研究在杉木根際篩選出的解無機(jī)磷菌 W1的 溶 磷 量 高 達(dá)238.08μg/mL，解 有 機(jī) 磷 菌Y9的溶磷量達(dá)15.04μg/mL.Y9菌株的有機(jī)磷溶解量大于范丙全等[44]在杉木根際篩選出的烏博內(nèi)氏伯克霍爾德菌(Burkholderiaubonensis)的解磷菌P5(溶磷量為195.61mg/L)，這可能是因?yàn)椴煌N類的微生物代謝機(jī)制具有多樣性，進(jìn)而導(dǎo)致分泌物種類和數(shù)量的不同，影響解 磷 微 生 物 的 解 磷 能 力[45];但 也 有 研 究指出，微生物、土壤的空間異質(zhì)性[46]以及生存環(huán)境[47]的差異均會(huì)對(duì)微生物與植物互作產(chǎn)生影響.
對(duì)兩株菌株基因序列進(jìn)行 Blast對(duì)比得到 W1為不動(dòng)桿菌屬，Y9為克雷伯氏菌屬.李文等[48]提出不動(dòng)桿菌可以在農(nóng)業(yè)中應(yīng)用以提高磷素的溶解量，他所篩選出的JL-1菌株溶磷量為118.04mg/L，解磷效果顯著弱于 W1.李夢(mèng)嬌等[49]研 究 得 出 克 雷 伯 氏 菌 屬(K. pneumoniae)對(duì) 于 增 強(qiáng) 植 物 的 溶 磷 能 力 具 有 重 要 作用，本研究的結(jié)果驗(yàn)證了高效解磷菌 的溶磷作用顯著.莊馥璐等[46]將篩選出的不動(dòng)桿菌屬 PsbM8菌 株回接擬南芥(Arabidopsisthaliana)后，根系附近有明顯的溶磷圈出現(xiàn)，進(jìn)一步得出不動(dòng)桿菌屬在解磷微生物的篩選與鑒定研究中應(yīng)用較廣泛的結(jié)論.目前常見報(bào)道的解磷菌主要有固氮菌屬(Azotobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽 孢 桿 菌 屬(Bacillus)、歐 文 氏菌屬(Erwinia)、根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、青霉屬(Penicillium)、根 霉 屬 (Rhizopus)和 鏈 霉 菌 屬(Streptomyces)[9，34，46].下一步亦可針對(duì)不同種屬解磷菌的解磷效果差異進(jìn)行探索.
選用高效菌株進(jìn)行培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件優(yōu)化，明晰菌株的最適宜生存環(huán) 境，促進(jìn)其發(fā)揮最大功效，為日后田間根際大規(guī)模應(yīng)用奠定基礎(chǔ).培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié) 果 表 明：W1 菌 株 與 Y9 菌 株 分 別 以 1.0% 和0.5% 的葡萄糖為最佳碳源，這與李文等[50]提出的不動(dòng)桿菌的最佳碳源為葡萄糖的結(jié)論一致;氮源的最佳選擇分別為1.50%和1.25%的酵母粉.南方紅壤區(qū)多呈酸性，Y9菌株偏向酸性環(huán)境，適宜應(yīng)用于南方杉木根際;而 W1菌株偏向堿性環(huán)境，可在實(shí)際應(yīng)用過程中加以調(diào)節(jié)土壤酸堿度，為 其 生 長 創(chuàng) 造 最 適 環(huán) 境.韋 宜慧等[51]在杉木根際篩選出烏博內(nèi)氏伯克霍爾德菌的P5菌株生長的pH 最適范圍為5～6，最適溫度為25～30℃.目前發(fā)現(xiàn)的解磷菌的最優(yōu)培養(yǎng)條件偏向高溫環(huán)境，解 磷 菌 的 功 效 可 能 與 溫 度 密 切 相 關(guān)，針 對(duì) 杉 木 主產(chǎn)區(qū)土溫較低的情況，有效降低目前現(xiàn)有優(yōu)勢(shì)解磷菌的最優(yōu)培養(yǎng)溫度是值得探索的方向.
隨著微生物與植物互作機(jī)制研究的日趨完善，根際微生物在 解 決 林 木 根 際 營 養(yǎng) 元 素 脅 迫 問 題 領(lǐng) 域 中的應(yīng)用前景將更加廣闊.現(xiàn)有研究主要探討解磷菌的篩選、鑒定、培養(yǎng)條件優(yōu)化及其作用機(jī)制，以期獲得菌株最 大 生 長 量，發(fā)揮高效解磷菌的最大效用.王 志 康等[52]提出土壤有機(jī)質(zhì)含量、碳氮比等是解磷微生物發(fā)揮作用的限制因子.為了更好地將解磷微生物應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)，在下一步研究中應(yīng)深入探討解磷菌與植物的互 作 機(jī) 制，可通過適當(dāng)調(diào)控環(huán)境因子，提 升 為 解 磷微生 物 生 存、生長所能提供的最大資源供應(yīng)量，以 滿足接種解磷菌的繁殖與生長需求，從而為利用微生物改善低磷脅迫環(huán)境提供最優(yōu)的菌種資源支持.——論文作者：趙 君1，饒惠玲1，王耘籽1，黃 偉1，吳承禎2，李 鍵1*
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