發(fā)布時(shí)間：2021-10-15所屬分類：農(nóng)業(yè)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要在自然界，角是野生動(dòng)物抵御天敵、爭(zhēng)奪配偶的工具，但在規(guī)�；B(yǎng)殖中，天生無(wú)角是有利性狀，可減少管理成本和保護(hù)動(dòng)物福利。牛(Bostaurus)無(wú)角性狀呈常染色體顯性遺傳，具有多等位基因特點(diǎn)，目前已知有3類不同來(lái)源的無(wú)角等位基因(奶牛:Friesian;肉牛、乳
摘要在自然界，角是野生動(dòng)物抵御天敵、爭(zhēng)奪配偶的工具，但在規(guī)模化養(yǎng)殖中，天生無(wú)角是有利性狀，可減少管理成本和保護(hù)動(dòng)物福利。牛(Bostaurus)無(wú)角性狀呈常染色體顯性遺傳，具有多等位基因特點(diǎn)，目前已知有3類不同來(lái)源的無(wú)角等位基因(奶牛:Friesian;肉牛、乳肉兼用牛:Celtic;蒙古牛:Mongolian)。為了開(kāi)發(fā)準(zhǔn)確高效的牛無(wú)角基因分子檢測(cè)方法，研究基于整合競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR(kompetitiveallele-specificPCR,KASP)和微流控芯片技術(shù)的檢測(cè)平臺(tái)，根據(jù)3種不同類型的結(jié)構(gòu)變異設(shè)計(jì)特異性引物，建立了針對(duì)3種牛無(wú)角基因的快速診斷方法。通過(guò)對(duì)采自國(guó)內(nèi)外不同牛品種的樣本檢測(cè)，并與PCR擴(kuò)增測(cè)序和凝膠電泳等傳統(tǒng)檢測(cè)方法的結(jié)果相對(duì)比，證明新方法可以對(duì)3種無(wú)角基因準(zhǔn)確分型，適于規(guī)�；瘷z測(cè)應(yīng)用。此外，本研究首次在我國(guó)三河牛品種中鑒定出Mongolian無(wú)角等位基因，同時(shí)在Friesian無(wú)角等位基因序列中新發(fā)現(xiàn)一個(gè)2bp缺失，可作為無(wú)角基因特異標(biāo)記。研究結(jié)果為開(kāi)展無(wú)角牛的分子選育提供了技術(shù)手段。
關(guān)鍵詞競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR(KASP);無(wú)角基因;三河牛;分子檢測(cè);微流控芯片
在自然界中，牛角是抵御天敵、爭(zhēng)奪配偶的工具(Robinsonetal.,2006;Johnstonetal.,2013);而在集約規(guī)模化養(yǎng)殖條件下，角的存在不僅給動(dòng)物間帶來(lái)互相傷害，也給飼養(yǎng)管理人員帶來(lái)安全威脅，故天生無(wú)角是牛人工養(yǎng)殖生產(chǎn)中的有利性狀。牛的無(wú)角性狀遺傳方式為常染色體顯性遺傳，具有多等位基因的特點(diǎn)，目前已知在普通牛(Bostaurus)中有3類不同來(lái)源的無(wú)角基因：Celtic等位基因(Medu‐goracetal.,2012)，存在于以安格斯牛、西門塔爾牛等肉�；蛉槿饧嬗门Ｆ贩N中，遺傳機(jī)制是1號(hào)染色體內(nèi)的一段212bp序列的重復(fù)，代替了長(zhǎng)度為10bp的序列;Mongolian等位基因(Medugoracetal.,2017)，發(fā)現(xiàn)于蒙古牛中，遺傳機(jī)制是1號(hào)染色體一個(gè)219bp的插入;Friesian等位基因(Medugoracetal.,2012)，存在于以荷斯坦牛、娟姍牛為代表的奶牛品種中，遺傳機(jī)制是1號(hào)染色體上一個(gè)80kb片段的重復(fù)。
開(kāi)發(fā)靈敏、準(zhǔn)確的牛無(wú)角基因的檢測(cè)方法，鑒定不同無(wú)角基因的基因型，對(duì)于培育無(wú)角牛具有重要應(yīng)用價(jià)值。目前國(guó)外研究者已報(bào)道了幾種傳統(tǒng)的分子檢測(cè)技術(shù)，例如PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳(Celtic,Mongolian,Friesian)(Medugoracetal.,2012;Medugoracetal.,2017;Wiedemaretal.,2014)、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳(Celtic,Friesian)(Wiedemaretal.,2014;Medugoracetal.,2012)、Sanger測(cè)序(Frie‐sian)(Wiedemaretal.,2014)。但這些檢測(cè)方法存在明顯缺陷：1)沒(méi)有統(tǒng)一的檢測(cè)技術(shù)能夠同時(shí)對(duì)3種無(wú)角等位基因進(jìn)行分型;2)瓊脂糖凝膠電泳、Sanger測(cè)序等傳統(tǒng)檢測(cè)方法，操作步驟多、耗時(shí)長(zhǎng)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè);3)針對(duì)Friesian無(wú)角基因，已報(bào)道的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，只能判斷是否攜帶無(wú)角基因，無(wú)法區(qū)分無(wú)角等位基因的雜合子和純合子，未達(dá)到精確分型的效果。競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR(kompetitiveallele-specificPCR,KASP)是近年來(lái)新出現(xiàn)的一種DNA變異分型技術(shù)，基于競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR原理，具有準(zhǔn)確、靈活、成本低的特點(diǎn)(Heetal.,2014)，對(duì)SNP、Indel及大片段缺失插入等不同變異類型均可檢測(cè)(Zhangetal.,2020)。本研究基于KASP和微流控芯片技術(shù)的檢測(cè)平臺(tái)，開(kāi)發(fā)針對(duì)3種牛無(wú)角基因的快速診斷方法，以適于規(guī)�；瘷z測(cè)應(yīng)用。
1材料與方法
1.1樣本及基因組DNA提取
樣本采自不同品種普通牛(Bostaurus)共39頭，其中奶牛9頭，品種為荷斯坦牛和娟姍牛;肉牛和兼用牛17頭，品種包括安格斯牛、西門塔爾牛(樣本來(lái)源于德國(guó)和美國(guó))、夏洛萊牛和利木贊牛;我國(guó)地方品種(三河牛、秦川牛和蒙古牛)牛12頭。這些樣本都具有表型信息，除秦川牛、蒙古牛樣本為血液，其余樣本均為冷凍精液。
利用試劑盒(基因組DNA提取試劑盒DP304，北京天根生化科技有限公司)提取血液樣本DNA。利用高鹽法提取牛凍精基因組DNA，具體步驟如下：1)將凍精置于2mL離心管中，加入500μL生理鹽水，渦旋混勻，12000r/min離心1min，倒去上清液保留沉淀。該步驟重復(fù)1次。2)向沉淀中加入400μL二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)裂解液、100μL20%的十二烷基硫酸鈉溶液(sodiumdodecylsulfate,SDS)，放置一段時(shí)間后渦旋，使之完全溶解，再加入10μL蛋白酶K，顛倒混勻。隨后將樣品置于56℃水浴鍋中消化20~22h。3)取消化好的樣品，加入300μL飽和食鹽水，顛倒2~3min，放入4℃冰箱靜置一會(huì)，隨后在4℃下12000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中。4)離心管中加入1000μL無(wú)水乙醇，顛倒1~2min，12000r/min離心2min，倒去上清液保留DNA沉淀。5)裝有DNA沉淀的離心管中加入500μL75%的乙醇，顛倒混勻，12000r/min離心2min，倒去上清液保留DNA沉淀。該步驟重復(fù)1次后，開(kāi)蓋放置使乙醇完全揮發(fā)。6)離心管中加入100μL56℃的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖液，4℃過(guò)夜，沉淀溶解。
最后利用ThermoScientificNanoDrop2000對(duì)基因組DNA質(zhì)量、濃度進(jìn)行檢測(cè)。
1.2基于整合KASP和微流控芯片技術(shù)的無(wú)角基因檢測(cè)
SNP分型采用基于微流控芯片的SNP檢測(cè)系統(tǒng)(iMAP,北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司)，其原理是在微流控芯片上完成基于等位基因特異擴(kuò)增原理的KASP分型。所用微流控芯片大小為75mm×25mm×2mm，具有112個(gè)反應(yīng)孔，分布于4排，每排28個(gè)孔，每個(gè)反應(yīng)孔體積1μL。除去預(yù)留作為對(duì)照的16個(gè)空白孔位(4個(gè)/排×4排)，該系統(tǒng)可以在2.5h內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)96個(gè)樣本(24個(gè)/排×4排)的分型檢測(cè)(Luetal.,2019)。
1.2.1特異性引物設(shè)計(jì)
根據(jù)3種無(wú)角等位基因的序列特征設(shè)計(jì)KASP特異性引物(表1)。
Celtic等位基因是牛1號(hào)染色體上1705834~1706045bp(牛UMD3.1版本參考基因組，下同)之間一段212bp序列發(fā)生重復(fù)，該重復(fù)代替了一段位于1706051~1706060bp長(zhǎng)度為10bp的序列，該位點(diǎn)表示為P202ID(Medugoracetal.,2012)。本研究根據(jù)P202ID重復(fù)序列末端的堿基差異性設(shè)計(jì)引物(圖1B)。
Mongolian等位基因有兩個(gè)特異性突變位點(diǎn)，一是在1975461~1975487bp處存在1bp的缺失(CTGAATC被替換為TCTGAA)，表示為P1ID;二是在1976128bp處存在一個(gè)219bp的插入，表示為P219ID(Medugoracetal.,2017)。本研究針對(duì)P1ID設(shè)計(jì)引物(圖1C)。
Friesian等位基因存在5個(gè)緊密連鎖的候選突變位點(diǎn)，其中3個(gè)是單核苷酸多態(tài)(SNP)，分別為：1654405bp處G→A(PG1654405A);1655463bp處C→T(PC1655463T);1768587bp處C→A(PC1768587A)。另外2個(gè)為插入缺失(InDel)，即在1649163~1649169bp處有一段5bp的InDel(P5ID)、在1909352~1989480bp后存在一段長(zhǎng)度為80128bp的串聯(lián)重復(fù)(P80kbID)，該串聯(lián)重復(fù)內(nèi)部還存在一個(gè)SNP(1909354:T→A)和一個(gè)2bp的缺失(1909396D2:TG)(Medugoracetal.,2012)。本研究針對(duì)此2bp缺失和PC1768587A分別設(shè)計(jì)了1組特異性引物(圖1A)。
每個(gè)引物組合含3條引物，包括上游引物2條和下游引物1條，其中2條上游引物是根據(jù)位點(diǎn)等位基因序列差異而設(shè)計(jì)的，在KASP擴(kuò)增過(guò)程中分別加上不同的熒光基團(tuán)，即羧基熒光素(FAM,car‐boxyfluorescein)和六氯熒光素(HEX,hexachlorofluorescein)，最后根據(jù)PCR產(chǎn)物熒光信號(hào)進(jìn)行基因型分型。引物由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司合成。
1.2.2競(jìng)爭(zhēng)性等位基因PCR(KASP)
表1中的4組引物，每組引物與模板DNA、PCR預(yù)混液以及雙蒸水組成一個(gè)PCR反應(yīng)體系，共組成4個(gè)PCR反應(yīng)體系，每個(gè)PCR反應(yīng)體系的體積為1μL。每個(gè)PCR反應(yīng)體系中包括引物混合液0.14μL，PCR預(yù)混液(2×universalKASPMasterMix,LGC)0.50μL，DNA模板5~10ng，雙蒸水補(bǔ)齊到總體積1μL。其中引物混合液中2條等位基因特異性引物濃度均為12µmol/L，下游通用引物濃度30µmol/L。上述4個(gè)PCR反應(yīng)體系可同時(shí)在微流控芯片(北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司,產(chǎn)品編號(hào)G020010)上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增程序均為：95℃變性15min，之后為降落PCR(touchdownPCR)擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)，變性溫度95℃，退火溫度在10個(gè)循環(huán)中從61℃降落到55℃，每個(gè)循環(huán)變性20s、延伸60s;然后為常規(guī)PCR擴(kuò)增26個(gè)循環(huán)，變性溫度95℃，退火溫度55℃，每個(gè)循環(huán)變性20s、延伸60s;最后37℃延伸60s。
PCR反應(yīng)完成之后，利用熒光信號(hào)掃描儀(北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品型號(hào)LuxScan10K/D)進(jìn)行掃描，生成圖像文件，通過(guò)軟件轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)信號(hào)值，根據(jù)熒光信號(hào)的散點(diǎn)圖判定基因型。
1.3KASP分型結(jié)果驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
1.3.1引物合成
利用Primer3.0(http://bioinfo.ut.ee/primer3/)在線設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)牛參考基因組(Bostauru⁃sUMD3.1;GenBank登錄號(hào)GCA_000003055.5)核苷酸序列，對(duì)P80kbID位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)出一條正向和反向引物。其他位點(diǎn)P202ID(Medugoracetal.,2012)，PC1768587A(Wiedemaretal.,2014)，P219ID(Medugoracetal.,2017)引物序列來(lái)自文獻(xiàn)報(bào)道(表2)。引物由擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。
1.3.2目標(biāo)序列的擴(kuò)增與凝膠電泳測(cè)序
以樣本基因組DNA為模板進(jìn)行目標(biāo)序列的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系總體積25µL，其中10×Buffer2.5µL，dNTP混合物(各2.5mmol/L)2µL，Taq酶(5U/µL)0.5µL，上下游引物(20µmol/L)各0.5µL，基因組DNA模板1µL(約50ng)。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min;然后35個(gè)循環(huán)，94℃變性30s，在引物對(duì)應(yīng)的退火溫度下復(fù)性30s，72℃延伸30s;最后72℃延伸7min。整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)在AppliedBiosystems9700型PCR儀內(nèi)完成。
P219ID、P80kbID和P202ID位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分型。制作濃度為2%的瓊脂糖凝膠，取每個(gè)樣品的PCR產(chǎn)物4µL點(diǎn)樣，在TAE緩沖液中110V電壓下電泳20min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果。PC1768587A位點(diǎn)采用PCR產(chǎn)物直接Sanger測(cè)序分型。
2結(jié)果與分析
2.1KASP檢測(cè)結(jié)果
利用KASP方法對(duì)所有39個(gè)樣本將3種不同類型無(wú)角基因同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，Celtic無(wú)角基因P202ID位點(diǎn)分型散點(diǎn)圖如圖2A所示，檢測(cè)到8個(gè)無(wú)角純合子，6個(gè)無(wú)角雜合子;Mongolian無(wú)角基因P1ID位點(diǎn)分型散點(diǎn)圖如圖2B所示，檢測(cè)到1個(gè)無(wú)角雜合子;Friesian無(wú)角基因P80kbID、PC1768587A位點(diǎn)分型散點(diǎn)圖分別如圖2C、圖2D所示，聯(lián)合檢測(cè)到9個(gè)無(wú)角突變個(gè)體，其中包括1個(gè)純合子和8個(gè)雜合子。
2.2Friesian無(wú)角基因序列分析
針對(duì)Friesian無(wú)角基因，本研究起初設(shè)計(jì)基于P80kbID位點(diǎn)的分型方法，但檢測(cè)結(jié)果顯示，該位點(diǎn)雖然能檢測(cè)出有無(wú)Friesian無(wú)角基因，但無(wú)法確定是純合子和還是雜合子。經(jīng)Sanger測(cè)序發(fā)現(xiàn)，野生型序列(圖3A)與突變型(圖3B)的第一個(gè)80kb拷貝序列在P80kbID位點(diǎn)的基因型完全一致，因此即使是突變型純合子，也會(huì)產(chǎn)生與野生型等位基因的檢測(cè)信號(hào)。為解決此難題，我們引入另外一個(gè)與Friesian無(wú)角基因關(guān)聯(lián)的突變位點(diǎn)(PC1768587A)，用于輔助判定無(wú)角基因的純合子或雜合子，檢測(cè)結(jié)果”CA”為無(wú)角雜合子，”AA”為無(wú)角純合子。與此同時(shí)，在對(duì)Friesian無(wú)角基因進(jìn)行Sanger測(cè)序時(shí)發(fā)現(xiàn)，在第2個(gè)80kb的串聯(lián)重復(fù)的起始處有一個(gè)長(zhǎng)度為2bp的缺失(AG)(圖3C;3D)。
2.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果
利用PCR擴(kuò)增和凝膠電泳實(shí)驗(yàn)以及Sanger測(cè)序?qū)ASP檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。Celtic無(wú)角基因P202ID位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果如圖4A所示，其中長(zhǎng)度為345bp的條帶對(duì)應(yīng)野生型，長(zhǎng)度為547bp的條帶對(duì)應(yīng)無(wú)角純合子，雙條帶對(duì)應(yīng)無(wú)角雜合子。在17個(gè)肉�；蛉槿饧嬗门悠分�，共有8個(gè)Celtic無(wú)角基因純合子、6個(gè)雜合子和3個(gè)野生型。對(duì)Mongolian無(wú)角基因P219ID位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果如圖4B所示，其中長(zhǎng)度為895bp的條帶對(duì)應(yīng)野生型，雙條帶對(duì)應(yīng)無(wú)角雜合子。在包括蒙古牛、秦川牛和三河牛在內(nèi)的13個(gè)樣品中，僅有1個(gè)三河牛樣本基因型為無(wú)角雜合，其余全為野生型。Friesian無(wú)角基因P80kbID位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果如圖4C所示，其中長(zhǎng)度為300bp的條帶對(duì)應(yīng)突變型，無(wú)條帶泳道對(duì)應(yīng)野生型。在包括荷斯坦牛和娟姍牛在內(nèi)的9個(gè)奶牛樣本中，有6個(gè)突變型，3個(gè)野生型。利用PC1768587A位點(diǎn)對(duì)Friesian無(wú)角基因進(jìn)行基因分型，在6個(gè)突變型中，有5個(gè)無(wú)角雜合子(圖4D,左)，1個(gè)無(wú)角純合子(圖4D,右)。
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將兩種檢測(cè)結(jié)果匯總后進(jìn)行對(duì)比(表3)，對(duì)KASP檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果表明，KASP的檢出率為100%，并且分型結(jié)果與分子實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全一致。
3討論
KASP是一種新型的SNP分型方法，具有快速、準(zhǔn)確、靈活性高等優(yōu)勢(shì)(Heetal.,2014;Zhangetal.,2020)，在不同領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。有報(bào)道利用KASP技術(shù)對(duì)兒童遺傳性耳聾進(jìn)行檢測(cè)(Luetal.,2019)，Rasheed等(2016)對(duì)影響小麥重要經(jīng)濟(jì)性狀的功能基因進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)小麥適應(yīng)性、產(chǎn)量和品質(zhì)等進(jìn)行篩選，以實(shí)現(xiàn)遺傳改良(Semagnetal.,2014)。Zhang等(2020)設(shè)計(jì)荷斯坦奶牛常見(jiàn)的8種遺傳缺陷的檢測(cè)方法。KASP分型技術(shù)的關(guān)鍵在于引物設(shè)計(jì)，本研究選取無(wú)角基因的特異性位點(diǎn)，包括Celtic無(wú)角基因位點(diǎn)P202ID，Mongolian無(wú)角基因位點(diǎn)P1ID成功設(shè)計(jì)了分型引物。但針對(duì)Friesian無(wú)角基因，本研究起初設(shè)計(jì)基于P80kbID位點(diǎn)的分型方法，但初步檢測(cè)顯示，P80kbID能檢測(cè)出有無(wú)Friesian無(wú)角基因，但無(wú)法確定是純合子和還是雜合子，原因是經(jīng)Sanger測(cè)序發(fā)現(xiàn)，野生型序列與突變型的第一個(gè)拷貝序列在P80kbID位點(diǎn)的基因型完全一致。故我們引入另外一個(gè)與Friesian無(wú)角基因密切關(guān)聯(lián)的突變位點(diǎn)(PC1768587A)，用于輔助判定無(wú)角基因的純合子或雜合子，實(shí)現(xiàn)Frie‐sian無(wú)角基因準(zhǔn)確分型。為了提高檢測(cè)效率，本研究使用了整合KASP與微流控芯片的檢測(cè)技術(shù)(Luetal.,2019)，使點(diǎn)樣、反應(yīng)、分型等基本操作單元集成到一塊75mm×25mm×2mm的芯片上，自動(dòng)完成分析過(guò)程，該技術(shù)適用于無(wú)角基因大規(guī)模檢測(cè)。
本研究對(duì)蒙古牛、秦川牛和三河牛等中國(guó)黃牛品種的無(wú)角基因進(jìn)行鑒定，首次在三河牛中檢測(cè)到Mongolian基因P1ID位點(diǎn)的存在。Mongolian基因最早由Medugorac等(2017)利用76頭�；蚪M測(cè)序數(shù)據(jù)，從蒙古國(guó)的蒙古牛(MongolianTuranocattle)上發(fā)現(xiàn)的，該無(wú)角基因在我國(guó)地方牛品種的分布還沒(méi)有報(bào)道。三河牛主要分布在我國(guó)內(nèi)蒙古額爾古納右旗三河地區(qū)，是我國(guó)培育的第一個(gè)乳肉兼用品種。該品種為西門塔爾牛、西伯利亞牛和俄國(guó)改良牛(如后貝加爾土種牛、塔吉爾牛等)與當(dāng)?shù)孛晒排＝?jīng)過(guò)長(zhǎng)期雜交后選育而成(吳宏軍等,2012)，故我們推測(cè)三河牛中無(wú)角基因很可能來(lái)自于蒙古牛。
Friesian基因共有5個(gè)候選突變，本研究中選擇P80kbID和PC1768587A兩個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物利用KASP進(jìn)行檢測(cè)。此前有報(bào)道表明P80kbID為Friesian基因最可能的致因突變，而PC1768587A和P80kbID高度連鎖，從表3檢測(cè)結(jié)果可知檢出率和準(zhǔn)確率均為100%，證明了突變位點(diǎn)的檢測(cè)準(zhǔn)確性。值得注意的是，本研究所檢測(cè)的2個(gè)德國(guó)西門塔爾牛樣本(編號(hào)6、8)內(nèi)，既檢測(cè)到P202ID位點(diǎn)，也檢測(cè)到PC1768587A和P80kbID這兩個(gè)位點(diǎn)。進(jìn)一步對(duì)這兩個(gè)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序后，結(jié)果與KASP一致。說(shuō)明這2個(gè)樣本同時(shí)攜帶Celtic、Friesian兩種不同無(wú)角等位基因。有研究表明(Schafberg等,2015)，人類對(duì)無(wú)角牛特殊的培育歷史使得Friesian和Celtic無(wú)角基因逐漸開(kāi)始滲透。Wiedemar等(2014)也發(fā)現(xiàn)Friesian基因也存在于少數(shù)西門塔爾牛中，而Celtic基因也存在于少數(shù)荷斯坦奶牛。Allais等(2013)和Rothammer等(2014)的研究結(jié)果也驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。本研究所開(kāi)發(fā)的KASP檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)在于對(duì)多個(gè)無(wú)角基因位點(diǎn)可同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，達(dá)到準(zhǔn)確分型的效果。
此外，本研究在對(duì)Friesian基因P80kbID位點(diǎn)內(nèi)兩個(gè)串聯(lián)重復(fù)進(jìn)行Sanger測(cè)序時(shí)發(fā)現(xiàn)，在第2個(gè)80kb的串聯(lián)重復(fù)開(kāi)始有一個(gè)長(zhǎng)度為2bp的缺失(AG),此前研究未報(bào)道該缺失的存在，屬首次發(fā)現(xiàn)。該分子標(biāo)記可以用于設(shè)計(jì)新的特異引物，進(jìn)一步優(yōu)化Friesian基因的檢測(cè)方法。
4結(jié)論
本研究利用競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR(KASP)技術(shù)開(kāi)發(fā)了3種類型無(wú)角基因的聯(lián)合分子檢測(cè)方法。與常規(guī)分子實(shí)驗(yàn)技術(shù)相比，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)無(wú)角基因的高效、快速、準(zhǔn)確檢測(cè);在中國(guó)本地牛品種中首次鑒定發(fā)現(xiàn)Mongolian無(wú)角基因，為無(wú)角黃牛的選育奠定了分子遺傳基礎(chǔ);在Friesian無(wú)角基因內(nèi)發(fā)現(xiàn)一個(gè)此前未報(bào)道的2bp缺失位點(diǎn)，為今后優(yōu)化檢測(cè)方法提供了可能。——論文作者：顏澤1肖煒2張勝利1王雅春1張毅1*
