發布時間：2020-04-23所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：本實驗以一株生香酵母異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)作為研究對象，對其菌劑制備進行了研究。結果表明該酵母的適宜離心條件為轉速4000r/min時間5min，此時酵母存活率達到86.21%;保護劑的最佳配比為5%海藻糖∶9%乳糖∶9%蔗糖=3∶5∶4;菌泥
摘要：本實驗以一株生香酵母異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)作為研究對象，對其菌劑制備進行了研究。結果表明該酵母的適宜離心條件為轉速4000r/min時間5min，此時酵母存活率達到86.21%;保護劑的最佳配比為5%海藻糖∶9%乳糖∶9%蔗糖=3∶5∶4;菌泥與保護劑體積比為1∶2時，異常威克漢姆酵母菌的凍干存活率為85.17%。
關鍵詞：異常威克漢姆酵母;冷凍干燥;正交實驗;保護劑
生香酵母是一類在發酵過程中能產生使人愉悅香味物質的酵母菌的統稱。其在發酵過程中能夠合成多種物質如酯、醇、酸和醛等產物，由于其產生的香味物質種類繁多，在傳統發酵食品如白酒、葡萄酒、醬油、醬類等生產中接入純種生香酵母進行發酵的技術已應用多年[1-2]。
相關期刊推薦：《食品與發酵科技》創于1973年，是由國家新聞出版總署批準在國內外公開發行的關于食品和發酵的技術性刊物。主要刊載食品、釀酒、發酵、飲料、微生物、調味品、農產品保鮮與深加工等領域的科研論文、技術報告、科技成果、新產品、新技術及相關行業政策、產業導向和市場信息等。在全國同待業中享有權威，擁有一批穩定的讀者群。
目前企業普遍采用的是菌種逐級擴大培養后再添加的方式，存在菌種退化、污染的可能，而活性酵母菌劑的應用可以有效避免以上問題[3]，同時，活性酵母菌劑有常溫下長期貯存而不失去活性、復活后穩定性高的特點[4]，有利于中小發酵食品企業產品品質的穩定和提升。
目前，酵母菌的干燥受到菌種、培養條件、干燥方式、保護劑等多因素的影響，不同菌種間存在明顯不同，目前，國內主要對釀酒酵母、魯氏酵母等主流生產酵母進行了菌劑制備研究，對異常威克漢姆酵母在菌劑制備方面的研究較少。因此本實驗針異常威克漢姆酵母菌劑制備進行研究，運用單因素試驗，對酵母的保護劑進行篩選，同時對效果比較好的保護劑進行組合優化，希望能達到更好的保護效果，為異常威克漢姆酵母的菌劑提供參考。
1材料與方法
1.1材料與設備
異常威克漢姆酵母2.1329由四川省微生物資源平臺菌種保藏中心分離、鑒定、保藏。
YPD基礎培養基：葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨2%，瓊脂粉2%，121℃滅菌20min。
葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂粉、海藻糖、蔗糖、乳糖、脫脂乳粉、麥芽糖、葡萄糖、谷氨酸鈉。SC-3614低速離心機安徽中科中佳科學儀器有限公;HZQ-X100恒溫震蕩培養箱太倉市實驗設備廠;SPX-250-Z生化培養箱上海博迅實業有限公司醫療設備廠;Edwards1739真空冷凍干燥器Ed⁃wardsHighVacuum(PartofB.O.CLtd.)Crawley.England。
1.2實驗方法
1.2.1生長曲線測定
挑取一環酵母純培養物接種于100mLYPD液體培養基中，28℃、150r/min震蕩培養15h，得活化種子液。
將酵母種子培養液以3%的接種量接入多瓶150mLYPD培養基中，28℃、150r/min震蕩培養，培養時間達到3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h時取樣品稀釋后，通過平板計數法進行活菌數計數，每個時間點做兩次平行。以培養時間為橫坐標，菌落數為縱坐標繪制菌株在該條件下的生長曲線。
1.2.2離心條件研究
不同的離心條件，對菌體的收集和活性有明顯影響，通過研究不同離心轉數和離心時間對酵母離心存活率的影響，尋求適宜的離心條件。將酵母發酵菌液分別以轉速3500、4000、4500、5000r/min、離心時間3、5、10、15min設定參數進行離心，取離心前菌液及離心后菌泥測定活菌數，計算離心存活率，確定適宜離心條件。
離心存活率(%)=沉降細胞活菌數(CFU/mL)/初始活菌數(CFU/mL)×100%[5]
1.2.3保護劑篩選
保護劑的加入可減輕冷凍和干燥兩個過程對菌體的損害，盡可能保持原有的各種生理生化特征和生物活性，提高凍干存活率，選取葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、脫脂奶粉、谷氨酸鈉作為凍干保護劑[6-8]，保護劑濃度設定為3%、5%、7%、9%。
將離心后得到的菌泥倒于滅菌的培養皿中，菌泥與保護劑按體積比1∶2混勻，制成菌懸液，用保鮮膜封好立即放入-30℃冰箱進行預凍，預凍時間為2h，預先開啟冷凍干燥機，待冷阱溫度降至-60℃，迅速將預凍好的菌體放進物料盤內，保鮮膜表面扎孔，關閉艙門開啟真空泵，真空冷凍干燥24h。通過平板計數法分別測定凍干前后的活菌數并計算存活率，確定最佳保護劑。
凍干存活率(%)=凍干后活菌數(CFU/mL)/凍干前活菌數(CFU/mL)×100%
1.2.4保護劑添加量實驗
以篩選后的保護劑為基礎，研究菌泥與保護劑添加比例對存活率的影響，將離心后得到的菌泥倒于滅菌的培養皿中，菌泥與保護劑按(1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3)比例添加后混勻，制成菌懸液。凍干方法參照1.2.3保護劑配方優化實驗，測定凍干前后活菌數，計算存活率。
1.2.5復配保護劑優化及驗證
根據保護劑篩選試驗結果，以三種保護劑作為因素研究最佳復配比例，選用L(934)表進行3因素3水平正交試驗[9]。以優化后的離心條件及保護劑進行酵母凍干菌劑制備，驗證實驗結果。
2結果與分析討論
2.1酵母生長曲線測定
通過對酵母生長至3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h這幾個時間點的活菌數測定，結果見圖1，由圖1可知，在接入菌種后的0-3h階段酵母處于遲滯期，3-9h酵母處于對數期，9h后活菌數趨于穩定，達到穩定期，考慮到菌體活性及特性，因此選擇12h作為發酵結束進行菌體收集時間點。
2.2離心條件研究
從圖2酵母在不同離心轉速及時間下的離心存活率折線圖可以看出，離心時的轉數和時間對菌體存活率有明顯影響，相同轉數條件下，酵母存活率隨離心時間的延長而提高，在離心時間達到5min后，酵母存活率隨離心時間的延長開始降低。在離心條件為轉速4000r/min離心時間5min時，測得最大酵母存活率為86.21%。
2.3保護劑篩選及濃度實驗
本實驗選取葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、脫脂奶粉、谷氨酸鈉作為凍干保護劑，考察保護劑種類和濃度對酵母菌凍干存活率的影響，結果見表2。
由表2可知，每種保護劑對菌體的冷凍干燥都有保護作用，其中蔗糖、海藻糖、乳糖做保護劑酵母的存活率相對更高。蔗糖濃度9%時酵母凍干存活率最高為76.59%，乳糖濃度9%時酵母凍干存活率最高為59.62%，海藻糖濃度5%時酵母凍干存活率最高為69.39%。因此，選擇蔗糖、乳糖和海藻糖三種保護劑做下一步實驗。
2.4保護劑添加量實驗
以蔗糖、海藻糖和乳糖三種保護劑為基礎，研究菌泥與保護劑比例對凍干存活率的影響，實驗結果見表3和圖3。
從表3和圖3可知，不同的保護劑以不同的比例添加酵母凍干存活率純在較大差異，5%海藻糖作為保護劑隨添加量的增加，酵母凍干存活率先升高后降低，在菌體∶保護劑=1∶2時，酵母凍干存活率最高達到67.77%;9%乳糖作為保護劑隨添加量的增加，酵母凍干存活率先升高后降低，在菌體∶保護劑=1∶2時，酵母凍干存活率最高達到81.31%;9%蔗糖作為保護劑隨著添加量的增加，凍干存活率先升高后降低，隨后再次升高，呈N字形趨勢，在菌體∶保護劑=1∶1.5時，酵母凍干存活率最高達到82.18%。
2.5保護劑復配優化
根據前面保護劑篩選試驗結果，以蔗糖、海藻糖、乳糖三種保護劑作為因素研究最佳復配比例，選用L(934)表進行3因素3水平正交試驗，試驗結果及極差分析見表4。
由正交試驗表4可看出，影響菌株凍干存活率的順序為：C>A>B，最優凍干保護劑組合為C3A1B3，此時，復配保護劑的比例為5%海藻糖∶9%乳糖∶9%蔗糖=3∶5∶4，菌泥∶復配保護劑=1∶2。以優化后的最優組合進行多次酵母冷凍干燥，最后測得平均凍干存活率為85.17%，基本符合優化條件。
3結論
通過一系列實驗表明，異常威克漢姆酵母菌株2.1329在離心轉速為4000r/min離心時間5min時，最大酵母存活率達到86.21%。以5%海藻糖、9%乳糖和9%蔗糖采用3∶5∶4的比例復配的保護劑是該菌的最佳保護劑，同時，采用體積比菌泥∶復配保護劑=1∶2時，異常威克漢姆酵母菌的凍干存活率達到85.17%。
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