發布時間：2020-04-18所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要:乳酸菌代謝過程中產生的抑菌物質乳酸菌素具有高效、無毒、無副作用、對環境無污染等優點，可有效抑制或殺死食品中產生的病原菌和腐敗菌，是一種天然防腐劑。金黃色葡萄球菌是食源性疾病的病原體之一，由其引起的食物中毒已成為世界性的公共問題。本文中
摘要:乳酸菌代謝過程中產生的抑菌物質乳酸菌素具有高效、無毒、無副作用、對環境無污染等優點，可有效抑制或殺死食品中產生的病原菌和腐敗菌，是一種天然防腐劑。金黃色葡萄球菌是食源性疾病的病原體之一，由其引起的食物中毒已成為世界性的公共問題。本文中，筆者以從發酵食品中分離的7株乳酸菌為研究對象，研究其對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，抑菌實驗采用瓊脂擴散法。結果表明:其中4株乳酸菌抑菌效果較好，最佳培養條件為37℃、靜置培養48h。在一定濃度范圍內，抑菌效果隨發酵液用量的增加而增大。所產乳酸菌素熱穩定性較強，且能在較寬的初始發酵pH范圍內保持活性。此研究結果為乳酸菌素的開發提供了一定的理論基礎。
關鍵詞:乳酸菌;乳酸菌素;抑菌效果;金黃色葡萄球菌;食物中毒
乳酸菌是能發酵糖類、主要代謝產物為乳酸的一類革蘭氏陽性菌，廣泛存在于各類食品中。乳酸菌在生長發酵過程中能產生抗菌物質，利用這一特點，乳酸菌在一定程度上能起到食品保鮮功能[1]。乳酸菌代謝過程中產生的抑菌物質———乳酸菌素，是起抑菌作用的最重要活性物質[2]。，是乳酸菌代謝過程中合成并分泌到環境中的一類對同種或親緣關系較近的菌株有抑制作用的殺菌蛋白或多肽物質，具有高效、無毒、無副作用、對環境無污染等優點，可有效抑制或殺死食品中產生的病原菌和腐敗菌[3-7]。同時，乳酸菌素易被人體消化道的部分蛋白酶分解，且不會在人體內蓄積而引起不良反應，因此被認為是一種具有廣闊應用前景的天然食品防腐劑、飼料添加劑和新的抑菌藥物。因此乳酸菌素將在人類疾病防治、動物醫藥保健及食品防腐等方面體現巨大的應用潛力[8-9]。近年來國內外許多學者研究發現乳酸菌細菌素不僅能抑制近源菌株的生長，還可抑制其他菌株的生長[10-11]。
金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是兼性厭氧的革蘭氏陽性菌，是醫療感染和食品中最常見的病原體之一，由其引起的食物中毒已成為世界性的公共衛生問題[12]。本研究中，筆者從發酵食品中分離7株乳酸菌，研究其對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，以期為金黃色葡萄球菌的防制提供一定的科學依據。
1材料與方法
1.1材料
從發酵食品中分離的乳酸菌的乳酸菌株A、B、a、b、c、d及e，保藏于青島農業大學發酵工程實驗室。
金黃色葡萄球菌，購于中國普通微生物菌種保藏中心，編號為1.8721。
MRS肉湯及MRS固體培養基、營養瓊脂及營養肉湯，青島海博生物技術有限公司。
NaCl、鹽酸、NaOH、乳酸等(分析純)，天津市北方天醫化學試劑廠。
1.2方法
1.2.1指示菌的活化
挑取在斜面培養基上保存的金黃色葡萄球菌菌苔分別接種于營養瓊脂培養基的斜面上，在37℃的恒溫箱中培養24h，然后在4℃條件下保存菌種，備用。
1.2.2具有金黃色葡萄球菌抑菌活性的乳酸菌的篩選
1)乳酸菌種子液及發酵上清液的制備
挑取斜面培養基上的乳酸菌菌苔接種到10mLMRS液體培養基中，于37℃靜置培養24h，作為種子液，備用。取種子液0.5mL接種于50mLMRS液體培養基中，振蕩均勻，在37℃恒溫培養箱中靜置培養48h后，在4℃條件下10000r/min離心10min，取上清液備用。
2)乳酸菌對指示菌的抑菌實驗
挑取1環活化保存的指示菌，接種于裝有生理鹽水的試管中，振蕩均勻，在凝固冷卻的營養瓊脂平板中央滴加0.1mL金黃色葡萄球菌的菌懸液，用涂布棒涂布均勻，靜置30min。用滅過菌的內徑為12mm的打孔器在涂布后的培養基上打孔，每個平板需等距離地打3個孔。分別取0.15mL乳酸菌發酵液接入打出的小孔中，將平板放于37℃恒溫培養箱中培養24h。觀察抑菌效果，測量并記錄抑菌圈的直徑大小。
3)乳酸對抑菌效果的影響
將乳酸標準液分別接入不同的MRS液體培養基中，調節pH與每株乳酸菌發酵上清液的pH相同，分別進行抑菌實驗。37℃培養24h后，觀察實驗結果，測量并記錄每株乳酸菌發酵上清液及乳酸標準液的抑菌圈直徑大小。
4)乳酸菌發酵液對抑菌效果的影響
分別取2、4、6、8和10mL乳酸菌發酵上清液加入到98、96、94、92和90mL的MRS液體培養基中，配成2%、4%、6%、8%和10%的乳酸菌發酵上清液液，進行抑菌效果的實驗。37℃培養24h后，觀察實驗結果，測量并記錄每株乳酸菌不同濃度菌液的抑菌圈直徑大小。
5)初始pH對乳酸菌抑菌效果的影響
用1mol/L的鹽酸和NaOH溶液將MRS液體培養基的pH分別調節至4、5、6、7和8，分別取0.5mL種子液接入調好pH的50mLMRS液體培養基中，放于37℃恒溫培養箱中培養48h，進行抑菌效果的實驗。37℃培養24h后，觀察實驗結果，測量并記錄每株乳酸菌不同pH條件下的抑菌圈直徑大小。
6)發酵時間對乳酸菌抑菌效果的影響
取種子液0.5mL接入50mLMRS液體培養基中，分別取培養時間為12、24、48和72h的乳酸菌上清液進行抑菌效果的實驗。37℃培養24h后，觀察實驗結果，測量并記錄每株乳酸菌不同發酵時間的抑菌圈直徑大小。
7)處理溫度對乳酸菌抑菌效果的影響
將乳酸菌發酵上清液放在60、80和100℃的條件下處理30min，進行抑菌效果的實驗。37℃培養24h后，觀察實驗結果，測量并記錄每株乳酸菌不同溫度條件下的抑菌圈直徑大小。
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2結果與討論
2.1乳酸菌抑菌效果的初步測定
利用筆者所在實驗室分離保存的7株乳酸菌分別對金黃色葡萄球菌進行抑菌實驗，結果如表1所示。
由表1可知，這7株菌對金黃色葡萄球菌都有一定的抑菌效果。其中，菌株B的抑菌效果最好，菌株a的抑菌效果最差。菌株A、B、b和e對金黃色葡萄球菌的抑菌效果明顯優于其他幾種指示菌。因此，后續實驗采用抑菌效果較好的菌株A、B、b和e進一步研究。榮鳳君[13]從4種發酵食品中篩選出了11株具有抑菌作用的乳酸菌，其中有4株對金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌效果;胡彥新等[14]從傳統發酵肉制品中分離出了63株乳酸菌，其中有2株對金黃色葡萄球菌有較明顯的抑制能力。
2.2乳酸菌發酵液對金黃色葡萄球菌抑制效果
2.2.1乳酸對抑菌效果的影響
考察4株乳酸菌發酵液及乳酸標準溶液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，結果如圖1所示。
由圖1可以看出:乳酸溶液對金黃色葡萄球菌有一定的抑菌效果，但是4株乳酸菌的抑菌效果顯著大于純乳酸的抑菌效果(P<0.05)，說明在乳酸菌發酵液中，除了乳酸外，還存在其他的抑菌物質，推測為乳酸菌素。郗恩光等[15]通過調節發酵上清液的pH來消除乳酸對抑菌效果的影響，而本研究是通過純品的乳酸作為對照來排除其影響。
2.2.2乳酸菌發酵液用量對抑菌效果的影響
考察4株乳酸菌發酵液體積分數對金黃色葡萄球菌抑菌效果的影響，結果如圖2所示。
由圖2可看出:在一定體積分數范圍內，隨著乳酸菌發酵液用量的增大，抑菌效果呈逐漸增強的趨勢，在設置的5個梯度中，菌株b在的發酵液體積分數為6%時，抑菌效果達到最大值，而菌株A、B和e的發酵液的體積分數為10%時的抑菌效果最佳。
由此可看出，菌株b的發酵液在低濃度時即能達到較好的抑菌效果，隨著濃度的繼續增大，抑菌效果基本不發生變化。
2.2.3初始pH對抑菌效果的影響
考察不同初始pH條件下，4株乳酸菌發酵液對金黃色葡萄球菌的抑制效果，結果如圖3所示。
由圖3可知:在初始pH為6左右時培養的4株菌，它們的發酵液抑菌效果最好;在pH<6的情況下，每株菌的抑菌效果隨著pH的增大而增強;在pH>6的情況下，抑菌效果隨著pH的增大而減弱。這可能是這4株乳酸菌在pH為6左右生長最好，產生了大量的乳酸及具有抑菌能力的生物活性物質。其中，初始pH在3～7時，菌株e的生長不受影響，而且它的發酵液有較好的抑菌效果，說明該菌株對初始pH的要求比較寬泛。
2.2.4發酵時間對抑菌效果的影響
考察不同發酵時間對4株乳酸菌的發酵液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，結果如圖4所示。
由圖4可看出:4株菌株在24h后抑菌效果趨于穩定，隨著培養時間的延長，抑菌效果增強緩慢，它們在發酵48h時的發酵液，對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，并且培養時間超過48h后，隨著培養時間的延長，抑菌效果基本不變。這說明，發酵液在不同的發酵時間，會產生不同的抑菌效果，培養時間48h，這4株菌的發酵液中抑菌活性物質的抑菌效果即可達到最好。趙藝竹等[16]的研究表明，隨著發酵時間延長，乳酸片球菌LAB12發酵上清液抑菌作用增強，22h時抑菌效果達到最大且趨于穩定;而植物乳桿菌LAB19在發酵約10h后，抑菌效果基本保持不變。因此，發酵時間對抑菌效果有較大的影響。
2.2.5處理溫度對乳酸菌發酵液抑菌效果的影響
考察不同溫度條件下處理后的4株乳酸菌的發酵液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，結果如圖5所示。
由圖5可知:5株乳酸菌發酵液在60和80℃處理30min后，仍然具有較好的抑菌效果，且60℃處理后的抑菌效果要優于80℃處理后的抑菌效果。在100℃處理30min后，失去抑菌效果，說明100℃高溫處理會使乳酸菌素遭到破壞，在80℃以下這4株乳酸菌的抑菌效果較穩定，即在巴氏殺菌的溫度范圍內穩定性較好，有潛力應用于食品中。
3結論
以從發酵食品中分離的7株乳酸菌為對象，研究其對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，結果表明，菌株A、B、b及e的抑菌效果較好。通過乳酸實驗表明，發酵液中含有除乳酸之外的抑菌成分，最佳發酵條培養時間為37℃、靜置培養48h。在一定濃度范圍內，隨著乳酸菌發酵液濃度的增大，抑菌效果呈逐漸增強的趨勢。4株菌能在較寬的初始發酵pH范圍內保持活性，且具有較好的溫度穩定性。因此，這4株乳酸菌的發酵產物對金黃色葡萄球菌有良好的抑菌作用，可進一步對其中的生物活性物質進行分離純化，為抑制金黃色葡萄球菌天然防腐劑開發與利用提供一定的研究基礎。
SCISSCIAHCI
